研究課題
本研究の目的はエプスタイン・バー・ウイルス関連リンパ増殖性疾患(Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disorder、以下EBV-LPD)に対するPD-1/PD-L1経路の新規阻害法として、PD-L1遺伝子発現抑制が使えるかを検討することである。そのために、PD-L1陽性EBV-LPDを用い、PD-L1発現に関わる転写因子とmicroRNAを同定する。現在までに、EBV-LPDにてEBV(+)細胞およびマクロファージがPD-L1陽性であることは確認された。また活性型リン酸化STAT1 (pSTAT1)に対する抗体を用いた免疫染色にて、EBV-LPDでは、pSTAT1陽性細胞分布が、PD-L1強陽性細胞の分布と概ね一致することも確認された。当初は、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1 遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認 (クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。以上から、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、①Trans AMキット(Active Motif社)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、②PD-L1 mRNAの3’非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、③細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、④細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。
2: おおむね順調に進展している
現在までに、EBV-LPDにてEBV(+)細胞およびマクロファージがPD-L1陽性であることは確認された。また活性型リン酸化STAT1 (pSTAT1)に対する抗体を用いた免疫染色にて、EBV-LPDでは、pSTAT1陽性細胞分布が、PD-L1強陽性細胞の分布と概ね一致することも確認された。当初の計画では、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1 遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認 (クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。また、PD-1がT-cell lymphomaの腫瘍陽性遺伝子である可能性 (Nature 552, 121 [2017])が報告され、さらに、PD-1/PD-L1療法により成人型T細胞性白血病/リンパ腫が増悪する例 (New England Journal of Medicine 378, 1947 [2018]; ただし反論あり)も報告された。以上から、当初の方針を以下のように微小修正した。すなわち、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、①Trans AMキット(Active Motif社)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、②PD-L1 mRNAの3’非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、③細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、④細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。
当初の計画では、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1 遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認 (クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。また、PD-1がT-cell lymphomaの腫瘍陽性遺伝子である可能性 (Nature 552, 121 [2017])が報告され、さらに、PD-1/PD-L1療法により成人型T細胞性白血病/リンパ腫が増悪する例 (New England Journal of Medicine 378, 1947 [2018]; ただし反論あり)も報告された。以上から、当初の方針を以下のように微小修正した。すなわち、当初の研究計画で2年目以降に予定していた細胞株を用いた機能アッセイを若干前倒しする。EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、①Trans AMキット(Active Motif社)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、②PD-L1 mRNAの3’非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、③細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、④細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。
当初の計画では、次に、EBV-LPD検体のホルマリン固定・パラフィン包埋検体から抽出したクロマチンを用いて、PD-L1 遺伝子制御領域へのSTAT1結合の確認 (クロマチン免疫沈降法)を予定していた。しかし、転写因子の細胞内での活性測定を、より直接的に早く行った方がよい、と新たに着想した。以上から、当初予定していたクロマチン沈降のキットの購入をpendingにした。このキットはActive Motif社のChIP-ITキットであり、1キットあたり約15万円(税込み)で、10症例相当分(3セット)として計上していた。そのため、このキット購入分の約45万円が次年度使用に回った。次年度は研究に関わる以下のような消耗品に使用を予定している。すなわち、EBV陽性細胞株及びマクロファージ細胞株を用い、①Trans AMキット(Active Motif社, 購入済)によりJAK/STAT経路の細胞内活性化を確認するとともに、②PD-L1 mRNAの3’非翻訳領域に結合するmicroRNAの同定も細胞株由来材料で行う、③細胞株において、当初計画していたJAK/STAT経路及びmicroRNAの操作に加え、RNA干渉などによるPD-L1遺伝子ノックダウンの影響も調べる、④細胞株への影響は、EBV陽性株単独、マクロファージ株単独、及び両者の共培養の3通りで検討する。
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