| 研究課題/領域番号 |
18K07025
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
潮見 隆之 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (80348797)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 肺気腫 / バイオマーカー / 質量分析計 |
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| 研究実績の概要 |
（計画１） MMP1による肺気腫特異的細胞外基質分解産物をはじめとした特異的生体分子のスクリーニングと同定
１）２次スクリーニング―ヒトMMP1トランスジェニック (以下MMP1TG) マウスおよび野生型マウス(以下WT)より、肺組織、BALおよび血清をサンプリングし、質量分析（LC-MS）による網羅解析の結果、これらの動物群で量的に差がある分子をスクリーニングした。これらの同定した分子について、サンプルの数を増やして特にBALおよび血清サンプルの分析を行い、確実に同定可能であり、特異的な分子を決定した。
２）３次スクリーニング―選抜された候補分子について、その特異性を検定した。MMP1 TGマウスにMMP1特異的活性阻害剤であるRo-32-3555を投与し、上記分子の量が特異的に変化することを確認した。これらのstepによりMMP1酵素活性に特異的な分子を同定した。
本年度は、昨年度同定した複数の候補分子について、２次スクリーニングを行った。具体的には、肺気腫発症マウスモデルからBALおよび血清を採取し、１次スクリーニングで同定できた分子の検出の可能性について検討した。結果、BALで検出できた候補分子が８分子、BALおよび血清の両方で検出できた分子が５分子であった。更に、どちらのサンプルからも検出できなかった分子は４分子であった。同定不能分子はいずれも細胞外基質分子であり、これらの物質はBAL及び血清分画に出現していないことが示唆された。現在、３次スクリーニングを遂行中である。ここではMMP1活性阻害剤をモデルマウスに投与し、これらの候補分子の量に変化があるかを検討する。これまで７分子の検討が終わり、３分子が阻害剤依存的に検出量が減少した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
１年目の実験の遅れを取り戻すべく研究を遂行したが、依然として遅れている。また本年度は２、３次スクリーニングで当初期待した検出感度を得ることが出来ず、その解決に多大な時間を要した。しかしながら、３次スクリーニングまで終了した分子群について、３分子のバイオマーカー候補を同定することが出来たのは大きな成果であり、プロジェクト全体の成果に結びつくクリティカルなステップを超えられたと考える。来年度は、残りのスクリーニングを終了させて、検出系の確立に臨む予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）３次スクリーニング―選抜された候補分子について、その特異性を検定する。MMP1 TGマウスにMMP1特異的活性阻害剤であるRo-32-3555を投与し、上記分子の量が特異的に変化することを確認する。これらのstepによりMMP1酵素活性に特異的な分子を同定する。
次に同定された分子に対して下記の実験を計画している。
２）生化学的アッセイ―MMP1と候補タンパク質を用い生化学的にその分解活性を検定する。具体的には、分解活性の時間・量依存性を確認し、分解産物の切断箇所を同定する。研究代表者は、生化学的実験に豊富な経験がある。また候補分子に関しては、マウスおよびヒト両方のタンパクを用い臨床応用する際に問題が生じないことを確認する（研究代表者：潮見担当）。
３）Neo-epidope抗体の確立―上記の実験で同定した候補分子がMMP1の基質であった場合には、neo-epidopeをターゲットとした分解産物特異的抗体の樹立を行う（抗体作成を外部受託の予定）。
4）上記抗体の確認―確立した抗体について、計画１で得られたBALおよび血清をサンプルとしてwestern blotを用いてin vivoモデルからの分子を測定可能であることを確認する。続いて最終ステップとしてELISA測定系の確立を行う。時にneo-epidope抗体の樹立が難しい場合があるが、その際にはタンパク質の切断部位を考慮の上、部位特異的なモノクローナル抗体を複数樹立し、これらを組み合わせることにより、分解産物特異的なELISA測定系を確立する。また１）で特異分子が直接的なMMP1分解基質ではないとされた場合は、候補分子に対する２種類以上の抗体を用いたELISA systemを確立する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
２、３次スクリーニングにおいて、検出感度が当初想定していたよりも低く、トラブルシューティングに非常に時間が掛かった。種々の検討の結果、MMP-1阻害剤自体がバックグランドノイズを上げることが判明し、サンプル調製の方法を大幅に変更することで必要な感度を得ることが出来た。本年度の研究については昨年度購入済みの試薬の使用で賄うことが出来た。
次年度については確実な研究遂行が見込まれてはいるが、全体的に進行が遅れているため、必要に応じて本研究計画について期間延長を考慮に入れている。
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