研究課題/領域番号 |
18K07025
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研究機関 | 国際医療福祉大学 |
研究代表者 |
潮見 隆之 国際医療福祉大学, 医学部, 教授 (80348797)
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研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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キーワード | 細胞外基質 / 分解酵素 / スクリーニング / 肺気腫 / バイオマーカー |
研究実績の概要 |
<研究計画>計画1 MMP1による肺気腫特異的細胞外基質分解産物をはじめとした特異的生体分子のスクリーニングと同定 1)3次スクリーニング―1次スクリーニングおよび2次スクリーニングを通して選抜されたバイオマーカー候補分子について、その特異性を検定する。MMP1 トランスジェニックマウスにMMP1特異的活性阻害剤であるRo-32-3555を投与し、上記分子の量が特異的に変化することを確認する。これらのstepによりMMP1酵素活性に特異的な分子を同定する。 続いて同定された分子に対して下記の実験を行った。 計画2 上記候補分子のin vitro/vivoでの確認と、検出系の確立1)生化学的アッセイ―MMP1と候補タンパク質を用い生化学的にその分解活性を検定する。具体的には、分解活性の時間・量依存性を確認し、分解産物の切断箇所を同定する。 <結果>本年度は、昨年度までに同定した複数の候補分子について、3次スクリーニングを遂行した。具体的にはMMP1活性阻害剤をモデルマウスに投与し、これらの候補分子の量に変化があるかを検討した。候補となった13分子中、合計で6分子について、活性阻害剤量依存的に特異的生体分子の減少が確認された。また3次スクリーニングが終わった分子の内、1分子について計画2で予定した生化学的アッセイを行い、精製した活性型MMP1および基質の時間及び量依存的分解活性を確認した。但し、研究の遅れに伴い分解産物の切断箇所を同定には至らなかったため、引き続き検定を行う予定である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本年度は新型コロナウイルス感染症の蔓延による大学研究室の一時閉鎖、また大学におけるオンラインおよびハイブリッド授業の実施による教育業務負担の大幅な増加により実験計画の遂行が大幅に遅れた。しかし計画1で予定した3次スクリーニングまではすべて終了し合計8分子のバイオマーカー候補を同定することが出来ため、肺気腫における新規バイオマーカーの開発というプロジェクト全体の成果に結びつく結果は得られたと考える。
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今後の研究の推進方策 |
大幅な研究計画の遅れにより、研究期間の1年間の延長を行った。本年度は最終年度として、バイオマーカー候補についての生化学的なバリデーション作業、および検出系の確立に臨む。具体的には以下の計画である。 1)本年度1分子について行った生化学的アッセイを、残りの候補タンパク質について実行する。 2)Neo-epidope抗体の確立―上記の実験で同定した候補分子がMMP1の基質であった場合には、neo-epidopeをターゲットとした分解産物特異的抗体の樹立を行う(抗体作成を外部受託の予定)。 3)上記抗体の確認―確立した抗体について、計画1で得られたBALおよび血清をサンプルとしてwestern blotを用いてin vivoモデルからの分子を測定可能であることを確認する。続いて最終ステップとしてELISA測定系の確立を行う。時にneo-epidope抗体の樹立が難しい場合があるが、その際にはタンパク質の切断部位を考慮の上、部位特異的なモノクローナル抗体を複数樹立し、これらを組み合わせることにより、分解産物特異的なELISA測定系を確立する。また1)で特異分子が直接的なMMP1分解基質ではないとされた場合は、候補分子に対する2種類以上の抗体を用いたELISA systemを確立する。
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次年度使用額が生じた理由 |
全体的な実験の遅れに伴い、予算執行が滞っている。本年度計画しているNeo-epidope抗体の確立に比較的高額の予算が必要なため、この実行により当初予定したプロジェクト全体としての予算執行が進む見込みである。当然のことであるが効率的な予算執行に努め、より高感度で臨床応用も念頭に置いたELISA systemの確率を目指す。
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