| 研究課題/領域番号 |
18K07030
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
水谷 泰嘉 藤田医科大学, 医学部, 助教 (10546229)
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| 研究分担者 |
塩竈 和也 藤田医科大学, 医療科学部, 講師 (10387699)
稲田 健一 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70246081)
鈴木 元 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80236017)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 酵素抗原法 / 形質細胞 / 抗体 / パラフィン包埋切片 / 固定 |
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| 研究実績の概要 |
酵素抗原法は、酵素やビオチンで標識した抗原をプローブとして、組織切片上の特異抗体産生細胞を可視化する技法である。ホルマリン固定パラフィン包埋切片では抗体失活により、本技法の適用が難しい。この問題を克服するため、これまでにhorseradish peroxidase（HRP）免疫ラットリンパ節における抗HRP抗体産生細胞を対象に、パラフィン包埋切片ではMethyl benzoate-Xylene（AMeX）、エタノールおよびアセトン、低融点パラフィン包埋切片ではperiodate lysine paraformaldehyde（PLP）および中性緩衝ホルマリンが抗体活性を良好に保持できる固定法であることを明らかにした。
本年度は、HRP以外の抗原に対する抗体でも、これら固定液で同様に抗体活性が保持されるかを検証した。keyhole limpet hemocyanin（KLH）、ovalbumin（OA）およびbovine serum albumin（BSA）の混合抗原を四肢足底部に皮下免疫したラットからリンパ節を採取した。AMeX、カルノア液、アセトン、エタノール、カルボジイミド、PLP、PLP-AMeX、ザンボニ液、ホルマリンの各固定液で組織を固定後、凍結切片およびパラフィン包埋切片を作製した。一部固定法について、低融点パラフィン包埋切片も検証した。各組織切片に対して酵素抗原法を行って、特異抗体産生細胞の染色性を比較した。
凍結切片ではエタノール、アセトン、PLPおよびザンボニ液が良好な染色性を示した。パラフィン切片ではAMeX、エタノールおよびアセトンが良好だった。低融点パラフィン切片では、PLPとザンボニ固定において良好な染色性が確認された。パラフィン切片の抗体活性保持には、固定液とパラフィンの種類の組み合せが重要であることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定していたパラフィン包埋切片および低融点パラフィン包埋切片で抗体活性を保持できる固定法の検索について、予定通り完了した。ホルマリン固定パラフィン包埋切片を対象とした高感度法を利用した酵素抗原法の応用については、現在検討中であり、予定よりやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の予定として、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を対象に、高感度法を利用した酵素抗原法の応用を検討する予定である。高感度法としてproximity ligation assay法、アミノ酸ポリマー法、Avidin-biotin complex（ABC）法などを検討する。既知抗原を免疫したラットリンパ節のホルマリン固定パラフィン包埋切片を対象に、ビオチン化抗原をプローブとして各種高感度法を検討して、有用な手法を選抜する。さらにコムギ無細胞系で合成した一分子ビオチン標識抗原をプローブとして、選抜した高感度法の応用性を検証する。ヘリコバクターピロリ（Hp）を免疫したラットのリンパ節を対象に、ビオチン化Hp抗原をプローブとして検討するほか、臨床検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて、検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた高感度法を利用した酵素抗原法の検討が未実施だったため、次年度使用額が生じた。この費用は、今年度に実施予定の高感度法の試薬購入に充てる予定である。その他、酵素抗原法の実施に必要な染色用試薬およびガラス・プラスチック器具類に充てる予定である。
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