酵素抗原法のパラフィン切片への応用：病変で作られる抗体の疾患網羅的解析をめざして

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07030
• 研究機関: 藤田医科大学
• 研究代表者: 水谷 泰嘉 藤田医科大学, 医学部, 助教 (10546229)
• 研究分担者: 塩竈 和也 藤田医科大学, 医療科学部, 講師 (10387699) ; 稲田 健一 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70246081) ; 鈴木 元 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80236017)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 酵素抗原法 / 抗体産生細胞 / パラフィン切片

研究実績の概要

酵素抗原法は、酵素やビオチンで標識した抗原をプローブとして、病理組織切片における特異抗体産生細胞（形質細胞）を可視化する免疫組織化学法である。本技法によって、病変部に浸潤する形質細胞が産生する特異抗体の標的抗原の同定とその抗体産生部位の同定が可能である。酵素抗原法は凍結切片に適用できるが、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片では抗体の失活のため適用困難な場合が多い。FFPE切片に本技法を適用できれば、病理診断用に保管されてきた多数の標本を研究対象とすることができる。そこで本研究は、FFPEブロックにおける酵素抗原法の確立を目的とする。これまでにパラフィン包埋切片でも抗体活性を維持できる固定法として、凝固固定が有効であることを見出した。
本年度は、ペプチドタグを標識した蛋白をプローブとして酵素抗原法の増感法を検討した。抗原蛋白のN末端にHisタグ、ビオチンおよび特異ペプチドタグを付加した蛋白をコムギ無細胞系により合成した。抗原蛋白を免疫したラットリンパ節のPFA固定後凍結切片を対象に、これらの標識蛋白をプローブとして酵素抗原法を実施した。HRP標識ストレプトアビジン、抗Hisタグ抗体および抗特異ペプチドタグ抗体で検出した場合の検出感度を比較した。なお、抗Hisタグ抗体と抗特異ペプチド抗体は、アミノ酸ポリマー法により検出した。HRP標識ストレプトアビジンによる検出と比較して、特異ペプチドタグを検出対象としたアミノ酸ポリマー法では、検出感度の向上が見られた。コムギ無細胞系で調製した抗原を酵素抗原法のプローブとしてパラフィン切片への応用するための有用な知見が得られた。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

酵素抗原法の増感法の検討に時間を費やしたため、予定していた単分子ビオチン標識リコンビナント抗原による酵素抗原法への着手が遅れた。以上より、進行がやや遅れている。

今後の研究の推進方策

単分子ビオチン標識リコンビナント抗原をプローブとする酵素抗原法を検討する。FFPE切片にはヘリコバクター・ピロリ（Hp）およびBSAを免疫したラットリンパ節のFFPE切片を用いる。コムギ無細胞系によりHp抗原およびBSAの単分子ビオチン標識蛋白をプローブとして調製する。

次年度使用額が生じた理由

リコンビナント抗原をプローブとした酵素抗原法の検討が一部未実施となっているため、次年度使用額が生じた。この費用は、今年度に実施予定のリコンビナント抗原の調製に必要な試薬の購入にあてる予定である。その他、酵素抗原法の実施に必要な染色用試薬およびガラス・プラスチック器具類に費用をあてる。

研究成果

• [雑誌論文] CEBPγ facilitates lamellipodia formation and cancer cell migration through CERS6 upregulation (2021)
  • 著者名/発表者名: Hanxiao Sh, Atsuko Niimi, Toshiyuki Takeuchi, Kazuya Shiogama, Yasuyoshi Mizutani, Taisuke Kajino, Kenichi Inada, Tetsunari Hase, Takahiro Hatta, Hirofumi Shibata, Takayuki Fukui, Toyofumi Fengshi Chen-Yoshikawa, Kazuki Nagano, Takashi Murate, Yoshiyuki Kawamoto, Shuta Tomida, Takashi Takahashi, Motoshi Suzuki
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 未定 ページ: 未定
  • DOI: 10.1111/cas.14928
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] AGIAタグ蛋白抗原プローブを用いた酵素抗原法の応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水谷泰嘉
  • 学会等名: 第109回日本病理学会総会