| 研究課題/領域番号 |
18K07048
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科大学 |
|---|
研究代表者 |
大野 慎一郎 東京医科大学, 医学部, 講師 (90513680)
|
|---|
| 研究分担者 |
熊谷 勝義 東京医科大学, 医学部, 助教 (20567911)
黒田 雅彦 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (80251304)
原田 裕一郎 東京医科大学, 医学部, 助手 (80570168)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | RNA干渉 |
|---|
| 研究実績の概要 |
応募者が開発した短縮型mimic miRNAは、RNA干渉を誘導する無修飾核酸として最短であり、in vivoおよびin vitroの実験から免疫応答を誘導しにくい特徴を有する。一方で、このような短いヘアピン構造のＲＮＡに、ＲＮＡ干渉活性があるという報告はなく、仮に生体内で類似の構造をとるノンコーディングＲＮＡが存在するのであれば、新規のＲＮＡ干渉核酸として機能していることが予想されたことから、本研究では生体内に存在する短鎖ヘアピンRNAの探索および機能解析を目的とした。はじめに、細胞からRNAを抽出し短鎖ＲＮＡの次世代シーケンスを行った。その中から３０塩基前後の配列情報を抽出し、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズム（Centroid Fold）により、ヘアピン構造をとるghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAを同定した。同定した内在性ghRNAのRNA干渉活性を調べるために、人工的に合成した内在性ghRNAを細胞へ導入し、マイクロアレイによりmRNAの発現変動の解析を行った。結果、内在性ghRNAの導入により、発現が抑制されるmRNAが多数同定された。また、その結果は、Real-time PCR法により再確認された。内在性ghRNAが制御する遺伝子の中には、がん等の疾患に関与する遺伝子もあり、新規RNA干渉機構であるghRNAの疾患への関与が示唆された。以上の成果は、第１０７回日本病理学会および第１０回日本RNAi研究会にて発表を行った。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成３０年度では、ghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAの探索および、同定した内在性ghRNAのRNA干渉活性の検証を主に行った。ghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAの探索では、抽出した短鎖ＲＮＡの次世代シーケンスデータを、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズムを用いて解析し、新規のghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAを複数同定した。また、同定した内在性ghRNAを合成し、予測される標的遺伝子に対するRNA干渉活性を確認した。従って、ほぼ計画通りに進行している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
新規のghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAを同定した。今後は、サンプル数を増やし、内在性ghRNAの同定数を増やすとともに、種間で保存されているghRNAの選別などを進める。また、同定した内在性のghRNAは、生理的機能の解析を明らかにするために、合成したghRNAを細胞へトランスフェクションし、マイクロアレイアッセイで標的遺伝子を同定する。さらにマイクロアレイの結果から、Gene OntologyもしくはKEGG pathway解析により、生理的機能の傾向を捉える。特に重要な標的遺伝子のノックダウンは、リアルタイムＰＣＲで厳密に測定し確認する。また、同定した内在性のghRNAのRNA干渉活性は、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイで検証する。任意のghRNAの相補配列をルシフェラーゼ遺伝子の３‘ＵＴＲに連結し、合成ghRNAをトランスフェクションした際のRNA干渉を発光抑制により検出する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
大きい額ではなく計画通りである。
|
