| 研究課題/領域番号 |
18K07048
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
大野 慎一郎 東京医科大学, 医学部, 講師 (90513680)
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| 研究分担者 |
熊谷 勝義 東京医科大学, 医学部, 助教 (20567911)
黒田 雅彦 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (80251304)
原田 裕一郎 東京医科大学, 医学部, 助手 (80570168)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RNA干渉 / microRNA |
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| 研究実績の概要 |
応募者が開発した短縮型mimic miRNAは、RNA干渉を誘導する無修飾核酸として最短であり、in vivoおよびin vitroの実験から免疫応答を誘導しにくい特徴を有する。一方で、このような短いヘアピン構造のＲＮＡに、ＲＮＡ干渉活性があるという報告はなく、仮に生体内で類似の構造をとるノンコーディングＲＮＡが存在するのであれば、新規のＲＮＡ干渉核酸として機能していることが予想されたことから、本研究では生体内に存在する短鎖ヘアピンRNAの探索および機能解析を目的とした。はじめに、細胞からRNAを抽出し短鎖ＲＮＡの次世代シーケンスを行った。その中から３０塩基前後の配列情報を抽出し、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズム（Centroid Fold）により、ヘアピン構造をとるghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAを同定した。同定した内在性ghRNAのRNA干渉活性を調べるために、人工的に合成した内在性ghRNAを細胞へ導入し、マイクロアレイによりmRNAの発現変動の解析を行った。結果、内在性ghRNAの導入により、発現が抑制されるmRNAが多数同定された。また、その結果は、Real-time PCR法により再確認された。同定した内在性のghRNAのRNA干渉活性は、ルシフェラーゼ遺伝子を用いたレポーターアッセイで検証した。内在性ghRNAの相補配列をルシフェラーゼ遺伝子の３‘ＵＴＲに連結し、合成ghRNAをトランスフェクションした際のRNA干渉を発光抑制により検出した。内在性ghRNAが制御する遺伝子の中には、がん等の疾患に関与する遺伝子もあり、新規RNA干渉機構であるghRNAの疾患への関与が示唆された。以上の成果は、第１０８回日本病理学会および第７８回日本癌学会にて発表を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和元年度では、ghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAの探索および、同定した内在性ghRNAのRNA干渉活性の検証を主に行った。ghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAの探索では、抽出した短鎖ＲＮＡの次世代シーケンスデータを、ＲＮＡ二次構造予測アルゴリズムを用いて解析し、新規のghRNA様二次構造の短鎖ノンコーディングRNAを複数同定した。また、同定した内在性ghRNAを合成し、予測される標的遺伝子に対するRNA干渉活性を確認した。現在は、完全に未知である内在性ghRNAの生成機構について解析を進めている。従って、ほぼ計画通りに進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究から内在性ghRNA（３０塩基前後で安定して存在するヘアピン構造のRNA）の存在とそのRNA干渉活性は確認できた。次の重要な課題は、内在性ghRNAの生成過程を明らかにする事である。内在性ghRNAの生成に関与する可能性があるリボヌクレアーゼを選定し、CRISPR/Cas9を用いて欠損細胞株を作製する。各種リボヌクレアーゼ欠損細胞株における、内在性ghRNAの発現パターンを解析し、生成過程を明らかにする。また、もう１つの課題は生理的重要性を明確に示すことである。しかし、内在性ghRNAの多くは、既に重要な機能が明らかなノンコーディングRNAの一部であり、欠損した細胞もしくは実験動物を作製することが困難である。従って、成熟したghRNAのみを吸着・阻害するRNA（スポンジRNA）を強発現するトランスジェニックマウスを作製中である。このマウスの解析により、内在性ghRNAの生理的役割を明らかにすることができる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大きい額ではなく計画通りである。
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