癌の転移先臓器決定と覚醒におけるCrkおよびExosomeの機能解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07059
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 津田 真寿美 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (30431307)
• 研究分担者: 田中 伸哉 北海道大学, 医学研究院, 教授 (70261287) ; 王 磊 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70637975)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: エクソソーム / 転移 / CRK

研究実績の概要

がんの転移についてはこれまで多数の研究が実施されてきたが、転移先臓器で長年潜伏していたがん細胞が何をきっかけに覚醒・再増殖するのか、また解剖学的位置関係からは説明をつけにくい臓器に転移・再発する理由はなぜか、その詳細な分子メカニズムは未だ解明されていない。申請者らはこれまで、シグナル伝達アダプター分子Crkががんの増殖・接着・ 浸潤・転移の全てのステップにおいて重要な役割を果たしていること、また最近、Crkががん組織の多様性形成に関与すると共に、エクソソームを介して転移の成立と促進に寄与する という新知見を見出した。これは、アダプター分子が転移先臓器の環境を整備しがん転移を成立させることを示唆する画期的なデータである。本研究では、Crkによるエクソソームの多様性形成メカニズムを明らかにし、がん転移の臓器選択性とがん細胞の覚醒との関連性を解明する。
当該年度は、ヒト浸潤性膀胱癌細胞株UM-UC-3の親株およびCrkノックダウン細胞から、超遠心法によりエクソソームを分離した。エクソソームに内包されている分子を、nano-LC MS/MS(蛋白質)で解析した所、受容体型チロシンキナーゼ、細胞内チロシンキナーゼ、細胞増殖因子、細胞外マトリックス、細胞接着分子、マトリックスメタロプロテアーゼなどが内包されていることが明らかとなった。これらの結果は、Western blottingによって確認された。各エクソソームを血管内皮細胞HUVECsに投与すると、UM-UC-3由来のエクソソームはHUVECsの細胞増殖能力、およびマトゲルへの浸潤能が行進することが明らかとなった。Crkノックダウン細胞由来のエクソソームはこれらの効果は認められなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、当初の予定通りに遂行されている。現在まで、特別な問題点や実験の遅れは生じていない。次年度以降も研究計画に沿って研究を遂行する。

今後の研究の推進方策

（１）Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん転移先臓器選択性の解析
マウスxenograftを用いて、エクソソームのヘテロジェナイティーとがんの転移先臓器との親和性を解析する。癌細胞から分離したエクソソームをPKH67で蛍光ラベルし、 ヌードマウスの尾静脈から接種。一日後にマウスのどの臓器に取込まれているかを蛍光顕微鏡下で観察する。さらに、エクソソームを連続投与して転移先臓器をeducate(教育)した後(1日置きに2週間、計6回投与)、tdTomato-Luc2導入野生型UM-UC-3細胞を尾静脈から接種し、一ヶ月後にIVIS spectrumを用いて転移巣の形成を観察。エクソソームのヘテロジェネイティーと転移先臓器との相関をパネル化する。一方、肺・肝・骨に転移した膀胱癌患者の血液中あるいは尿中からエクソソームを採取しマウスxenograftで得られた知見との一致性につい て検討する。
（２）Crk依存的エクソソームヘテロジェナイティー形成とがん細胞の覚醒との関連性解析
種々の癌腫由来のがん細胞に細胞周期の進行をモニタリングするFucciベクターを導入後、高濃度BrdU処理によりがん細胞に細胞老化を誘導。その後、エクソソームを処理し、どのエクソソームがどの癌腫の休眠状態のがん細胞を覚醒(再増殖)できるかをタイムラプス蛍光顕微鏡下で解析する。覚醒前後のがん細胞は、EMT、がん幹細胞、ヒストンメチル化関連分子に対する免疫染色を施行し、がん細胞の動態を解析す る。これらを、野生型およびCrk knock-down細胞由来のエクソソーム間で比較し、Crkが 制御するがん転移先臓器選択性とがん細胞覚醒化の全体像をパネル化する。

研究成果

• [雑誌論文] Chorionic Gonadotropin-β Modulates Epithelial-Mesenchymal Transition in Colorectal Carcinoma Metastasis (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawamata F, Nishihara H, Homma S, Kato Y, Tsuda M, Konishi Y, Wang L, Kohsaka S, Liu C, Yoshida T, Tanino M, Tanaka S, Kawamura H, Kamiyama T, Taketomi A.
  • 雑誌名: The American Journal of Pathology 巻: 188 ページ: 204～215
  • DOI: 10.1016/j.ajpath.2017.08.034.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A clinicopathological analysis of six autopsy cases of sudden unexpected death due to infectious aortitis in patients with aortic tears. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa M, Tanino MA, Miyazaki M, Kimura T, Ishida Y, Wang L, Tsuda M, Nishihara H, Nagashima K, Tanaka S.
  • 雑誌名: Intern Med. 巻: 57 ページ: 1375-1380
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.8976-17.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pathologic findings and clinical course of midline paraventricular gliomas diagnosed using a neuroendoscope. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fukami S, Nakajima N, Okada H, Akimoto J, Miki T, Fukuhara H, Shishido-Hara Y, Nagao T, Tsuda M, Kohno M.
  • 雑誌名: World Neurosurg. 巻: 114 ページ: e366-e377
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.02.185.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Pre-treatment evaluation of FRET-based drug sensitivity test for patients with CML treated with dasatinib. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo T, Fujioka M, Tsuda M, Murai K, Yamaguchi K, Miyagishima T, Shindo M, Nagashima T, Wakasa K, Fujimoto N, Yamamoto S, Yonezumi M, Saito S, Sato S, Ogawa K, Chou T, Watanabe R, Kato Y, Takahashi S, Okano Y, Yamamoto J, Ohta M, Iijima H, Oba K, Kishino S, Sakamoto J, Ishida Y, Ohba Y, Teshima T.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 109 ページ: 2256-2265
  • DOI: 10.1111/cas.13625.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tough and self-recoverable thin hydrogel membranes for biological applications. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ye YN, Frauenlob M, Wang L, Tsuda M, Sun TL, Cui K, Takahashi R, Zhang HJ, Nakajima T, Nonoyama T, Kurokawa T, Tanaka S, Gong JP.
  • 雑誌名: Advanced Functional Materials. 巻: 28 ページ: 1801489
  • DOI: 10.1002/adfm.201801489.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Tumor budding and human chorionic gonadotropin-β expression correlate with unfavorable patient outcome in colorectal carcinoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Konishi Y, Kawamata F, Nishihara H, Homma S, Kato Y, Tsuda M, Kohsaka S, Einama T, Liu C, Yoshida T, Nagatsu A, Tanino M, Tanaka S, Kawamura H, Kamiyama T, Taketomi A.
  • 雑誌名: Med Oncol. 巻: 35 ページ: 104
  • DOI: 10.1007/s12032-018-1164-x.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] “Integrated diagnosis” of pilocytic astrocytoma: Molecular diagnostic procedure for an unusual case. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishida Y, Tsuda M, Sawamura Y, Fujii K, Murai H, Horiuchi N, Orba Y, Sawa H, Hall WW, Nagashima K, Tanaka S.
  • 雑誌名: Pathology Int. 巻: 68 ページ: 694-699
  • DOI: 10.1111/pin.12734.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] miR-23a promotes invasion of glioblastoma via HOXD10-regulated glial-mesenchymal transition. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yachi K, Tsuda M, Kohsaka S, Wang L, Oda Y, Tanikawa S, Ohba Y, Tanaka S.
  • 雑誌名: Signal Transduction and Targeted Therapy. 巻: 3 ページ: 33
  • DOI: 10.1038/s41392-018-0033-6.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] SFRP1はチロシンキナーゼ阻害剤耐性膠芽腫細胞における癌幹細胞性獲得に関与する (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴鹿 淳、津田 真寿美、王 磊、谷野 美智枝、田中 伸哉
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [学会発表] 高分子ハイドロゲルによる滑膜肉腫幹細胞誘導メカニズムの解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 倉井毅、津田真寿美、王磊、木村太一、鈴鹿淳、青山佳代子、安田和則、グン剣萍、田中伸哉
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [学会発表] 脳腫瘍組織像の画像解析と遺伝子プロファイルに対応したDeep-Learning法の応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石田雄介、杉野弘和、谷野美智枝、津田真寿美、田中伸哉
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [学会発表] 悪性神経膠腫におけるIDH1遺伝子変異による放射線照射後変化の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 北崎アリサ、谷野美智枝、九笹めい、杉野弘和、王磊、石田雄介、津田真寿美、五十嵐香織、曽我朋義、田中伸哉
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [学会発表] Development of bipolar charge hydrogel for neuronal tissue engineering (2018)
  • 著者名/発表者名: Satoshi Tanikawa, Shongo Semba, Masumi Tsuda, Lei Wang, Mishie Tanino, Yusuke Ishida, Hirokazu Sugino, Jun Suzuka, Shinya Tanaka
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [学会発表] 神経再生工学における両電荷を有するハイドロゲルの開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 谷川 聖, 仙葉 慎吾, 津田 真寿美, 王 磊, 谷野 美智枝, 石田 雄介, 杉野 弘和, 田中 伸哉
  • 学会等名: 第37回分子病理学研究会
• [学会発表] 膠芽腫の血管周囲微小環境における腫瘍細胞と血管周皮細胞および血管内皮細胞との相互作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 戎優樹、王磊、津田真寿美、田中伸哉
  • 学会等名: 第15回日本病理学会カンファレンス
• [学会発表] Analysis of glioblastoma stemness-inducing master regulated molecules on double-network hydrogel (2018)
  • 著者名/発表者名: Jun Suzuka, Masumi Tsuda, Lei Wang, Shinya Tanaka
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] ハイドロゲルによる新規迅速癌幹細胞誘導法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中伸哉、鈴鹿淳、王磊、津田真寿美
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 膵癌におけるシグナル伝達アダプター分子Crkの役割の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 植村慧子、津田真寿美、王磊、田中伸哉：膵癌におけるシグナル伝達アダプター分子Crkの役割の解析
  • 学会等名: 第98回北海道医学大会腫瘍系分科会
• [学会発表] 両荷電を有するハイドロゲルを用いた神経細胞の3D培養への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 谷川聖、仙葉慎吾、津田真寿美、王磊、田中伸哉
  • 学会等名: 第40回神経組織培養研究会
• [学会発表] 高分子ハイドロゲル誘導膠芽腫幹細胞においてイオンチャネル阻害剤がもたらす影響の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 鈴鹿淳、鉢呂彩花、津田真寿美、王磊、安田和則、グン剣萍、田中伸哉
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 高分子ハイドロゲルによる癌幹細胞へのリプログラミング誘導技術 (2018)
  • 著者名/発表者名: 津田真寿美、鈴鹿淳、王磊、仙葉慎吾、油谷幸代、黒川孝幸、近江谷克裕、安田和則、グン剣萍、田中伸哉
  • 学会等名: 第107回日本病理学会総会
• [備考]
  • URL: http://patho2.med.hokudai.ac.jp/