| 研究課題/領域番号 |
18K07064
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
宮崎 大吾 信州大学, 医学部附属病院, 講師(特定雇用) (80596370)
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| 研究分担者 |
中村 昭則 信州大学, 医学部, 特任教授 (10303471)
柴 直子 信州大学, 医学部, 助教(特定雇用) (00639289)
柴 祐司 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (70613503)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | デュシェンヌ型筋ジストロフィー / 心筋細胞 / 心不全 |
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| 研究実績の概要 |
DMD遺伝子にエクソン46-55欠失を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）患者の末梢血からiPS細胞を樹立し、分化誘導により心筋細胞（DMD-iPSC-CMs）を作成した。このDMD-iPSC-CMsと健常対象由来の心筋（Control-iPSC-CMs）へのマイクロアレイ解析とqPCR解析による比較検討から細胞増殖や再生に関与する複数の候補遺伝子を見出した。また、DMD-iPSC-CMsに対してDMD遺伝子エクソン45特異的なモルフォリノオリゴを用いたエクソン45スキップを行うことでアウトオブフレーム型からイン・フレーム型に誘導し、欠損していたジストロフィンのタンパク発現回復が起こることを確認した。さらに、エクソン45スキップによって、DMD-iPSC-CMsにおいて上記候補遺伝子の中で特にTMSB4XとIGF2の遺伝子発現が回復することが確認できた。
これらの研究結果からDMDにおける心筋障害の進展にTMSB4XやIGF2といった遺伝子の発現変化が関与している可能性を考えておりTMSB4XとIGF2の発現低下に伴う心筋障害のプロセス解明のためこれらの遺伝子に対するsiRNAを用いた遺伝子ノックダウンを試みている。HEK293細胞に対してTMSB4X、IGF2遺伝子に対するsiRNAをリポフェクタミン試薬を用いて導入を行い、いずれも85％-90%の遺伝子発現抑制効果を確認できた。また、TMSB4X遺伝子発現抑制によりIGF2遺伝子発現が抑制され、2つの遺伝子の作用に関連があることが確認できた。現在iPS心筋を用いた検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今までTMSB4XとIGF2に対するsiRNAの導入によっても十分な遺伝子発現抑制効果が得られていなかったが、遺伝子導入試薬の変更と細胞数調整によって85%-90%と十分な遺伝子発現抑制効果が安定して得られるようになった。このため現在は心筋細胞を用いた研究を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
iPS心筋に対するTMSB4X、IGF2遺伝子抑制に伴う心筋細胞の細胞内シグナル変化や細胞機能の変化に関して評価し、TMSB4XとIGF2の発現低下に伴う心筋障害のプロセス解明につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度でiPS心筋細胞における遺伝子抑制による影響を評価するため、心筋培養とカルシウムイメージングを用いた心筋細胞機能評価を集中して行う必要がある。このため次年度に124,860円を繰り越した。
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