| 研究課題/領域番号 |
18K07078
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| 研究機関 | 関西医科大学 |
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研究代表者 |
安藤 祐吾 関西医科大学, 医学部, 講師 (50388427)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | miR-21 / IBD / PDCD4 |
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| 研究実績の概要 |
炎症性腸疾患（IBD）患者および、IL-10 knock out マウス、デキストラン硫酸（DSS）誘導マウス腸炎モデルなどの様々なIBDモデルマウスの腸管粘膜においてmiR-21が高発現していることが報告されている。しかし、生体内でmiR-21が大腸炎の発症および慢性化にどのような役割を果たしているのかについて、未だ明らかにされていない。本研究ではIBDモデルマウスであるdominant negative TGF-β Receptor II (dnTGF-βRII)マウスを用いて、miR-21が in vivo, in vitro においてどのような役割を果たしているか検証する。
初年度である平成３０年度は、dnTGF-βRIIマウスおよびmiR-21 knock out (miR-21KO) マウスをアメリカ合衆国のThe Jackson laboratoryより購入（輸入）し、動物飼育センターでの飼育繁殖を開始した。マウス購入後は、genetic backgroundがB6;129SであるmiR-21KO mouseをdnTGF-bRIIマウスと同じC57BL/6(B6)へ置き換える為にback cross (The Jackson LaboratoryのSpeed Congenic Serviceを利用)を開始し、現在、N9まで到達している。今後、N10までback crossを進め、dnTGF-bRIIマウスとmiR-21KOマウスとの掛け合わせを開始する予定である。In vitroの実験では、dnTGF-βRIIマウスおよびB6マウスの脾臓および腸間膜リンパ節からCD4+T細胞を分離回収し、miR-21発現量およびmiR-21のtarget geneの一つであるProgrammed cell death 4 (PDCD4)発現量をRT-PCR法を用いて測定した。その結果、dnTGF-βRIIマウスのCD4+T細胞ではmiR-21が高発現していることが確認された。その一方で、dnTGF-βRIIマウスのCD4+T細胞ではPDCD4のmRNA発現量はB6マウスと比較してmRNAレベルでの発現量は低下していることを確認した。現在、PDCD4のタンパクレベルでの発現量の変化についてもwestern blotting法を用いて測定を実施している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本実験は、IBDモデルマウスにおいてmiR-21がどのような役割を果たしているかを検証する実験である。したがって、IBDモデルマウスであるdnTGF-βRIIマウスとmiR-21KOマウスを掛け合わすことにより、まずはmiR-21-/-dnTGF-βRIIマウスを作成する必要がある。dnTGF-βRIIマウスおよびmiR-21KOマウスは、The Jackson laboratoryより購入可能であるが、genetic back groundが異なるマウスである為、これらのマウスを掛け合わせる前にback crossして、同じgenetic back groundへ変換する必要がある。その為、初年度はback crossに約1年前後の時間を要すると予測された。現在、N9までback crossは進んでおり、概ね予定通り順調に作業は進展していると考える。
マウスのback crossと並行して、in vitroの実験を開始し、RT-PCR法およびwestern blotting法のset upおよびpreliminary data測定を実施し、次年度以降にマウスの必要頭数が集まり次第、本実験を実施する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
B6へのback crossが完了後、dnTGF-βRIIマウスとmiR-21KOマウスを交配させてmiR-21-/-dnTGF-βRIIマウスを作成する。マウスは24週齢で屠殺し、血清、各臓器を採取し、各種assayへ用いる。採取した組織の一部で組織標本を作成し、炎症細胞浸潤の程度をスコア化する。次に、マウスから採取した脾臓と腸間膜リンパ節は、比重遠心法を用いて単核細胞を分離し、細胞表面マーカーで染色してT細胞活性化を評価する。また、CD4+T細胞とCD8+T細胞によるサイトカイン産生能を調べる為に、炎症性サイトカインをintracellular stainingにより評価する。CD4+/CD8＋T細胞は、比重遠心法で回収された単核細胞を用いて、positive selectionによりCD4+/CD8＋T細胞を回収する。腸管粘膜内の単核細胞の回収方法は、コラゲナーゼVを用いて腸管組織を消化分解することにより単核細胞を分離回収する。腸管組織内のサイトカインは、大腸粘膜をホモジナイズし、CBA Cytokine kitを用いて測定する。炎症とmiR-21の関連性については、miR-21発現量および各種サイトカインのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて定量し解析する。次に、miR-21の標的遺伝子であるPDCD4は、RT-PCR法およびWestern blotting法を用いてPDCD4のmRNA発現量およびタンパク質量を測定する。また、miR-21が細胞増殖やアポトーシスに及ぼす影響について、CFSE Cell Proliferation assayおよびAnnexin V binding assayにより検証する。マウスの全身状態および生存率を評価するために、体重、生存率、各臓器の病理組織、腸管長、腸管重量を測定し、全身および腸管局所の炎症の程度を客観的に評価する。
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