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2018 年度 実施状況報告書

多段階発がん過程におけるMeis1経路の網羅的機能解析

研究課題

研究課題/領域番号 18K07080
研究機関千葉県がんセンター(研究所)

研究代表者

若林 雄一  千葉県がんセンター(研究所), がんゲノムセンター 実験動物研究部, 部長 (40303119)

研究分担者 磯貝 恵理子  千葉県がんセンター(研究所), 発がん研究グループ 実験動物研究室, 上席研究員 (40300917)
研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード扁平上皮がん / DMBA / TPA
研究実績の概要

変異原性物質であるDMBA(dimethylbenz(a)anthracene)と炎症剤であるTPA(tetradecanoyl-phorbol-acetone)を用いて誘導した良性腫瘍パピローマ、皮膚扁平上皮がん、コントロールとして正常皮膚からクロマチンを分離し、anti-Meis1抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿したクロマチンからDNAを抽出してsequencingを行うというChIP sequencingを行った。その結果、悪性腫瘍において48のMeis1結合ピークが検出された。次に、これらのピークがシス領域に存在すると考えられる遺伝子を抽出したところ10個の遺伝子が検出された。このうち、4つの遺伝子(Dedd2、Sh2b1、Cep120、Stk25)の発現がMeis1ノックダウン細胞からRNAを抽出してqRT-PCRを行い発現を確認したところ、Meis1の発現と連動することを確認した。これらの遺伝子の中から耐糖能との関連が知られるStk25遺伝子の機能解析から行った。Stk25のノックダウン細胞株を皮膚扁平上皮がん細胞のB9を用いて作製した。するとこの細胞株はMeis1ノックダウン細胞株と同様に細胞遊走と増殖能に異常を来すことが判明した。さらにプロモーター領域をクローニングしてルシフェラーゼアッセイを行った。Meis1の全長cDNA配列とStk25のプロモーター領域を連結させたルシフェラーゼコンストラクトを同時にB9細胞にトランスフェクションしたところ、強いルシフェラーゼ活性が検出され、Stk25がMeis1の下流で機能することが確認された。Meis1ノックダウン細胞株にStk25を高発現させたところ、遊走能にはそれほど影響を与えなかったが、増殖能はレスキューされるという結果が得られた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

DMBA(dimethylbenz(a)anthracene)と炎症剤であるTPA(tetradecanoyl-phorbol-acetone)を用いて誘導した良性腫瘍パピローマ、皮膚扁平上皮がん、コントロールとして正常皮膚からクロマチンを分離し、anti-Meis1抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿したクロマチンからDNAを抽出してsequencingを行うというChIP sequencingを行い、ピークが得られた。すなわち、primary tumorsから分離したクロマチンを用いたChIP sequencingの実験系が期待した通りに動き、その結果、検出されたStk25がMeis1の下流で機能するという結果が得られた。さらにはこれらの結果をvalidationするために皮膚扁平上皮がん由来細胞株から調整したクロマチン分画を用いてクロマチン免疫沈降を行った。これらの解析結果はまだ得られていないが、十分なクロマチン量が得られていることからsequencing反応に進む準備は整ったと考える。以上から、予定した実験内容はおおむね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

皮膚扁平上皮がん由来細胞株から調整したクロマチン分画を用いてクロマチン免疫沈降を行ったサンプルのsequencingを進め、validationを行う。さらにはStk25以外のDedd2、Sh2b1、Cep120についてもノックダウン細胞株を調整して機能解析を進める。クルマチンのみならず、RNAを用いたトランスクリプトーム解析も進め、Meis1経路の機能解析を網羅的に進める。

次年度使用額が生じた理由

初年度はデータ解析に時間を費やしたこと、また、手持ちの試薬等でまかなえたことから、残金が生じた。次年度以降は実際の検証実験に時間、試薬を費やすことから、残金の使用が見込まれる。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (6件)

  • [雑誌論文] A Polymorphic Variant in p19Arf Confers Resistance to Chemically Induced Skin Tumors by Activating the p53 Pathway2019

    • 著者名/発表者名
      Saito M, Okumura K, Isogai E, Araki K, Tanikawa C, Matsuda K, Kamijo T, Kominami R, Wakabayashi Y.
    • 雑誌名

      Journal of Investigative Dermatology

      巻: in press ページ: in press

    • DOI

      10.1016/j.jid.2018.12.027

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model2018

    • 著者名/発表者名
      Aoto Y, Okumura K, Hachiya T, Hase S, Sato K, Wakabayashi Y, Ishikawa F and Sakakibara Y.
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 12994

    • DOI

      10.1038/s41598-018-31349-x

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] The role of PTH in mouse skin tumorigenesis2018

    • 著者名/発表者名
      Okumura K, Saito M, and Wakabayashi Y.
    • 雑誌名

      Integrative Cancer Science and Therapeutics

      巻: 5 ページ: 1000271

    • DOI

      10.15761/ICST.1000271

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 順遺伝学的手法により明らかとなったマウス副甲状腺ホルモンの腫瘍抑制効果2018

    • 著者名/発表者名
      奥村和弘, 斎藤慈, 磯貝恵理子, 三浦郁夫, 若菜茂晴, 山口碧, 設楽浩志, 多屋長治, 木南凌, 若林雄一
    • 学会等名
      第65回日本実験動物学会総会富山市富山県民会館
  • [学会発表] がん抑制遺伝子p19Arfに存在する非同義置換多型の機能解析2018

    • 著者名/発表者名
      斎藤慈、奥村和弘、磯貝恵理子、若林雄一
    • 学会等名
      第65回日本実験動物学会総会富山市富山県民会館
  • [学会発表] 順遺伝学に基づくMSMマウスのがん耐性に関与する遺伝子の同定2018

    • 著者名/発表者名
      奥村和弘, 斎藤慈, 磯貝恵理子, 若林雄一
    • 学会等名
      第31回モロシヌス研究会札幌市北海道大学地球環境科学研究院
  • [学会発表] がん抑制遺伝子p19Arfに存在する非同義置換多型の腫瘍悪性化における役割2018

    • 著者名/発表者名
      斎藤慈, 奥村和弘, 磯貝恵理子, 若林雄一
    • 学会等名
      第31回モロシヌス研究会札幌市北海道大学地球環境科学研究院
  • [学会発表] 皮膚早期良性腫瘍抵抗性遺伝子座Stmm1aの原因遺伝子の同定2018

    • 著者名/発表者名
      奥村和弘, 斎藤慈, 磯貝恵理子, 荒木喜美, 若林雄一
    • 学会等名
      第77回日本癌学会学術総会大阪市大阪国際会議場
  • [学会発表] p19Arfに存在する非同義置換多型の腫瘍悪性化を制御する2018

    • 著者名/発表者名
      斎藤慈, 奥村和弘, 磯貝恵理子, 荒木喜美, 若林雄一
    • 学会等名
      第77回日本癌学会学術総会大阪市大阪国際会議場

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公開日: 2019-12-27  

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