| 研究課題/領域番号 |
18K07103
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
亀井 克彦 千葉大学, 真菌医学研究センター, 教授 (10214545)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 病原真菌 / アスペルギルス症 / 耐性化 / 血清 / バイオフィルム |
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| 研究実績の概要 |
・Aspergillus fumigatusのbiofiom形成はアスペルギルス症の難治化の観点から、また近年世界的な問題となっているアスペルギルスのアゾール耐性化の母地と推測されている点からも極めて重要である。我々はヒト血清中のfetuinAがbiofilm形成を促進することを見いだしたが、血清中にはその他にも同等の強い活性を持つ物質の存在が示唆されている。この研究はこの新たなbiofilm形成促進因子の発見と関連遺伝子やこれらと耐性化との関連の探索を通じて、治療に結びつけることを目的としている。
・これまでbiofilmの判定に用いられてきた煩雑な乾燥重量測定法に代わるものとして、新たなbiofilm定量法を確立し、本研究で用いる事でその有用性を確認した。
・血清中の新たな活性物質の探索では、fetuin Aとほぼ同等の強いbiofilm誘導活性をもつ画分を認め、新たに可視化に成功するとともに、さらに分画中の因子の同定を進めている。
・Biofilm形成促進物質の解析中に、血清中にA. fumigatusの生育およびbiofilm形成を強く抑制する活性をもつ複合体の存在を確認し、複合体に含まれる活性成分の解析を進めている。
・同一クローンの臨床分離株における薬剤感受性とbiofilm形成能の関連性については、得られる臨床分離株数の収集速度が遅い事もあり、未だ結論を得られていない。そこでCYP51AのCRISPR-Cas9を用いた遺伝子操作によりさまざまに耐性化した株を作成し、biofilm形成能の検討を行なうこととし、既に目的とする株の作成を完了して、現在、biofilm形成能の検討を進めているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
血清中のbiofilm形成促進物質の同定及び作用機序の解明.
血清中に存在するAspergillus fumigatusの新たなbiofilm ECM(ExtraCellular Matrix)形成促進物質の分離・同定については、目的としていたfetuin Aとほぼ同等の強力なbiofilm形成促進活性を示した低分子量画分を分離し、トリクロロ酢酸／アセトン沈殿による濃縮と銀染色法を利用することで可視化が行えた。更に解析を進めたもののスメアなバンドとして存在し、その成分はまだ複雑であると考えられた。現在、分画中の因子の同定を進めている。
研究を進める中で、血清中に強力なA. fumigatusの生育抑制活性をもつ画分を見いだした。血清中の複合体の1つである事が判明したが、複合体に含まれる主要タンパク質成分のみではA. fumigatusの生育抑制は確認できず、本成分の生育阻害効果について検討を進めている。
・Biofilm形成の遺伝子の探索研究、薬剤感受性が異なる同一クローンの臨床分離株同志でbiofilm形成能の比較研究を続けているが、当初予定したペースで株の収集が進んでいない.そこでCRISPR-Cas9によるCYP51Aの遺伝子操作によりさまざまに耐性化したA. fumigatusの株を作成してそれらのbiofilm形成能の検討を行なうこととした。既に、耐性化した株の作成を終えており、現在、biofilm作成能の検討を進めているところである。なお、久留米大学との共同研究にて、Streptococcus pneumoniaeがそのhydrogen peroxideによりA. fumigatusのbiofilm形成の阻害及び破壊をもたらす事を示した。これは完成したbiofilmをもつアスペルギルス症における対する治療の新しい方向性を示すものと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
・血清中に存在するAspergillus fumigatusのbiofilm(ECM)形成促進物質の分離・同定について：
現在、これまでの活性が確認された解析が進んでいる物質について単離を進め、質量分析などを用いた同定作業を行なう。確認できればその機序、codeする遺伝子発現の解析、ついで破壊株の作成とそのphenotype(biofilm作成能)の確認を行う。破壊株などについては電子顕微鏡による詳細なbiofilmの形態観察を行なう。また研究の当初の枠組みから若干外れるが、本研究の過程において確認された血清中のbiofilm形成の抑制物質についても、本生体内におけるbiofilm形成という観点から重要と考えられ、期間中に是非結論を得たいと考えている。
・Biofilm形成に関与する遺伝子の探索研究について：
同一クローンの株を用いたbiofilm形成能の詳細な確認とこれらの比較ゲノム法による解析は継続して推進するが、これと並行して、CRISPR-Cas9によるCYP51Aの遺伝子操作により耐性化したA. fumigatusの株を用い、それらのbiofilm形成能の検討を行なうことにより、耐性化とbiofilm形成の関連を明確にする。biofilm形成能の異なる菌株でparasexual reproductionとこれらを用いた比較ゲノム解析については、parasexual reproductionが難航しているが、更に工夫を重ねて結論を得たいと考えている。
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