研究課題
腸管系病原菌は、宿主常在菌の影響や粘液層などのバリアを巧みに掻い潜りながら標的部位を認識し、宿主への付着と定着を達成する。本研究では、申請者が新たに提案する細菌のIV型線毛と分泌タンパク質との相互作用を介して実現されるユニークな付着メカニズムを、細胞アッセイを含む分子生物学的手法や構造生物学的手法により検証し、腸管系病原菌の初期付着過程の構造学的基盤を解明することを目指している。これまでの研究から、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）が保有するIV型線毛であるCFA/IIIの立体構造モデルを構築し、さらに、線毛先端部に存在するマイナーピリンCofBと分泌タンパク質CofJの相互作用様式を、X線結晶構造解析により原子レベルで解明した。この結果から、CofBはC末端側のH型レクチン様ドメインで分泌タンパク質を認識し、腸管上皮への付着を実現することが示されたが、付着に直接関与する分泌タンパク質CofJの標的は明らかになっていなかった。2019年度は、分泌タンパク質CofJの腸管上皮認識機構を解明するため、既知のCofJの立体構造を用いたホモロジー検索を行った。その結果、CofJは、膜孔形成毒素の一種であるα-hemolysinと構造類似性があることが分かり、また構造中にチロシン等の芳香族アミノ酸のクラスターを有していることから、脂質膜との相互作用が考えられた。そこで、ブタ脳より抽出した脂質混合物からなるリポソームを調製し、共沈実験、及び走査型電子顕微鏡による相互作用解析を実施したところ、どちらの実験においてもCofJと脂質膜の結合が観察された。このことから、分泌タンパク質CofJは脂質膜を認識することが明らかになった。
2: おおむね順調に進展している
これまでの研究から、ETECが保有するIV型線毛が、線毛先端部において分泌タンパク質を認識することで付着能を発揮するユニークなモデルの提唱に至ったが、依然として、線毛の最先端部において分泌タンパク質がどの様に宿主腸管上皮を認識するかは不明であった。本研究において、分泌タンパク質と膜孔形成毒素との類似性を明らかにし、脂質膜との相互作用を実験的に確認することで、対象とする分泌タンパク質が細胞膜に含まれる脂質を認識している可能性を示唆する結果を得ることが出来た。
2019年度の研究からETECの腸管付着に関与する分泌タンパク質CofJが脂質認識に関与することを明らかにすることが出来た。しかしながら、実験に用いた脂質は、ブタ脳より抽出した脂質混合物であり、分泌タンパク質CofJの脂質選択性については明らかになっていない。そのため、今後は、脂質組成の異なるリポソームを各々調製し、結合実験を実施するほか、脂質アレイキットなどを用いて、脂質選択性に関して情報取得を目指す予定である。また、CofJが特定の脂質を認識することが明らかになった場合は、CofJと脂質との複合体結晶を作製し、X線結晶構造解析により原子レベルで相互作用情報を得る予定である。
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SPring-8/SACLA Research Frontiers 2018
巻: 2019 ページ: 9-10
http://www.phs.osaka-u.ac.jp/homepage/b001/
