| 研究課題/領域番号 |
18K07114
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| 研究機関 | 十文字学園女子大学 |
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研究代表者 |
成谷 宏文 十文字学園女子大学, 人間生活学部, 教授 (30452668)
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| 研究分担者 |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 教授 (40333512)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | Clostridium perfringens / ガス壊疽菌 / シグナル伝達 / プロテインキナーゼ / プロテインホスファターゼ / 細胞壁生合成 / タンパク質相互作用 / Yeast Two-Hybrid Screen |
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| 研究実績の概要 |
グラム陽性病原細菌に普遍的に存在する真核型 Protein Ser/Thr Kinase (K) - Phosphatase (P)シグナル伝達系の機能をClostridiumperfringens (ガス壊疽菌)をモデルとして解明する。我々は既に、K のリン酸化基質タンパク質としてClostridium属細菌に特異的な繰り返しタンパク質相互作用領域 (TPR) を有する膜タンパク質 (S) を同定し、そのThr-92のリン酸化調節で同菌の隔壁形成・分裂・形態（菌長）を制御することを見いだしている。また S が必須酵素: IspG（非メ
バロン酸経路: 細胞壁生合成に関与）と MurF (D-Ala-D-Ala Ligase:細胞壁生合成経路)との相互作用を見いだしている。
本研究では、タンパク質間の相互作用がいくつも統合された高次ネットワークで行われる菌の『形態形成』における S-IspG-MurF複合体形成 と K-P 制御のメカニズムを明らかにする事を目的とする。具体的には in vivo Cross-Link 法によりS 複合体を K・P欠損株より単離し、その構成因子をLC-MS/MS により同定する。またK (二量体) の酸性アミノ酸(Glu/Asp)-Rich 領域の機能として His-Aspリン酸リレー系(Protein His Kinase) の走化性制御で知られる『メチル化Adaptation機構』を念頭に、Glu 変異株の解析、また Glu/Asp-Rich 領域との相互作用因子の同定を行う。本年度は、以下について検討を行う予定であったが、新型コロナの影響で昨年度に引き続き，まだ予備実験段階で進捗していないため，補助事業再延長を行なった。
1）S の新規相互作用因子の探索：候補因子の情報収集
2）他のClostridium属細菌S ホモログの比較解析/リン酸化部位決定：未実施
3）K の酸性アミノ酸領域の機能解析：ツールのデザイン
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
昨年度に引き続き，研究室の体制準備等が十分でなく、遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度、予定していた以下について、完遂する。
1）S の新規相互作用因子の探索：LC-MS/MS解析を行い、特定された因子の欠損株作製等の遺伝子解析を行う。
2）他のClostridium属細菌S ホモログの比較解析/リン酸化部位決定：リン酸化タンパク質の分画をAffinity Chromatographyで行い、Phosho-Thr/Ser抗体による
Western-Blott解析で確認後、LC-MS/MS解析によりリン酸化部位を含めタンパク質の特定を行う。
3）K の酸性アミノ酸領域の機能解析とKのシグナル分子の同定：作製した酸性アミノ酸領域の欠損/変異体の菌形態等の表現型を確認する。シグナル分子の同定
については、新規エンドリシン Amidase等 による細胞壁分解物およびD-Ala-D-Alaの添加によるリン酸化シグナル伝達系への影響等を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
LC-MS/MS解析の未発注のため（昨年度の消耗品を使用し研究を行なった）、次年度使用額が生じた。残額については、研究課題の完遂のため，LC-MS/MS解析の外注費用（５０万程度）等に当てる。
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