腸管出血性大腸菌におけるプロファージ間相互作用と宿主菌進化へのインパクトの解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07116
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 中村 佳司 九州大学, 医学研究院, 助教 (60706216)
• 研究分担者: 澤口 朗 宮崎大学, 医学部, 教授 (30336292)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 腸管出血性大腸菌 / Stx2ファージ / サテライトファージ

研究実績の概要

申請者は、腸管出血性大腸菌 (EHEC)のゲノム内において、ファージが別のプロファージゲノム内に溶原化していることを新たに見出した。本研究の目的は、新規の「ファージ内ファージ」に関して、ファージ共存パターンを解析し、新たなファージ間相互作用を明らかにするとともに、その形質変化への影響を解明することにある。
本年度は、溶原化ファージの2つのパターンのうち、Stx2ファージが重複し、さらに片方のStx2ファージが別のプロファージゲノム (P0)内に組み込まれていたEHEC株を用いた解析を主に行った。本菌株に重複していたStx2ファージ、およびP0ファージを脱落させた株を作製した（それぞれDP1,DP2,DP0とする）。各株のStx2産生量を測定して野生型と比較すると、いずれの欠損株についても野生型の約半分のStx2産生量を示した。このことから、DP0がDP1やDP2と同程度のStx2産生量となることが明らかとなり、「ファージ内ファージ」がStx2産生量に何らかの影響を与えていることが示唆された。
予想外の出来事として、本解析に使用していたStx2産生量の測定系(Sandwich ELISA)に関係する試薬が手に入らなくなったため、新たにStx2産生量の測定系を樹立した。新たな測定系により、より簡便なStx2産生量の測定が可能となった（詳細は後述の現在までの進捗状況の理由の項目を参照）。
また、もうひとつの新規溶原化ファージパターンである、ラムダ型サテライト様ファージに関して、類似した溶原化パターンをこれまでに見出した系統とは異なる系統に属する大腸菌株のゲノムより見出した。このことは今後の実験に使用できる菌株が増えただけではなく、見出した現象の一般性を高めることができるという点で非常に重要であると考えられた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本解析において重要なStx2の産生性を評価する方法として、Sandwich ELISAによる測定系を利用していたが、抗体が固層化されたELISAプレートを入手することができなくなったため、新たにStx2の測定系を構築する必要に迫られた。このため、当初予定していた研究計画より少し遅れている。一方で、新たな系はHTRF (Homologous Time Resolved FRET)を測定原理とし、標識抗体とサンプルを混合するだけで、サンプル特異的なシグナルを得ることができる。これにより、簡便に数多くのサンプルを処理することができるようになり、今後より効率的にデータを取得することが可能になると考えられる。
また、Stx2ファージが別のプロファージに溶原化していることで生じるStx2ファージの誘導効率に関して評価するためのファージ誘発条件を確定させ、さらに、「ファージ内ファージ」がStx2産生量に影響を与えていることが示唆されるデータも得られた。ラムダ型サテライト様ファージに関しても、これまでとは別の大腸菌系統に属する研究室保存株より新たに類似した溶原化パターンを見出した。
以上のことから、研究計画自体は多少遅れているものの、ある程度順調に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

Stx2ファージの「ファージ内ファージ」に関して、ファージを誘発させる条件がある程度決まったため、次年度はより詳細にファージ誘導能を評価する。具体的には、Stx2ファージ誘発後のファージ誘導効率を、時間経過とともに増加するStx2産生量およびStx2ファージのコピー数を測定し、親株と各欠失株の間で比較する。また、本実験で使用した菌株のStx2ファージをK-12株（ファージ粒子非産生株）に溶原化させ、Stx2ファージ自身の誘導能を様々なタイプのStx2ファージと比較する。
ラムダ型サテライトファージの「ファージ内ファージ」に関しては、当初の計画通り、サテライト様ファージの解析を行う。実際の評価項目は、上述のStx2ファージの誘導能に関する解析と類似していることから、同時進行が可能であると考えている。基本的な機能評価を行った後、サテライト様ファージが溶原化したK-12株の中から、サテライト様ファージが誘発される溶原株を検索・同定することを次年度の目標として行う。

研究成果

• [学会発表] Genome diversity of EHEC O145:H28 and genome-wide search of high Stx2 producibility-associated genes (2018)
  • 著者名/発表者名: Keiji Nakamura, Kazunori Murase, Atsushi Toyoda, Takehiko Itoh, Jacques Georges Mainil, Shuji Yoshino, Keiko Kimata, Junko Isobe, Kazuko Seto, Yoshiki Etoh, Hiroshi Narimatsu, Shioko Saito, Jun Yatsuyanagi, Sunao Iyoda, Makoto Ohnishi, Tadasuke Ooka, Yasuhiro Gotoh, Yoshitoshi Ogura, Tetsuya Hayashi
  • 学会等名: 10th International symposium on Shiga Toxin producing Escherichia coli Infections (VTEC2018)
  • 国際学会
• [学会発表] O157堺株Stx2ファージの形態形成に必須な遺伝子の同定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 金宗鉉、中村佳司、後藤恭宏、小椋義俊、林哲也
  • 学会等名: 第22回腸管出血性大腸菌大腸菌感染症研究会