| 研究課題/領域番号 |
18K07160
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
山本 直樹 公益財団法人東京都医学総合研究所, 疾患制御研究分野, 主任研究員 (10547780)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | HBV cccDNA |
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| 研究実績の概要 |
B型肝炎ウイルス(HBV)は肝炎、肝硬変および肝癌の原因ウイルスのひとつである。HBVは乳幼児期に感染すると高い確率で持続感染化する。HBVゲノムDNAは部分的に一本鎖の不完全二本鎖DNA(relaxed circular DNA: rcDNA)でウイルス粒子内に封入されている。一方、感染肝細胞の核内では完全な二本鎖閉環状DNA(covalently closed circular DNA: cccDNA)として染色体とは独立して一定量維持されることで持続感染化する。通常、染色体外DNAは安定性が低いとされている。cccDNAの維持メカニズムとしては、全長ウイルスRNAから逆転写された一部のrcDNAが核に再移行することで一定量のcccDNAを維持させる「リサイクル経路」が考えられているが、未だ明らかにされていない。
これまで、逆転写酵素阻害剤やHBV mRNAを標的としたsiRNAを用いてリサイクル経路に関わるウイルスRNA、コア蛋白質および逆転写酵素を阻害してもcccDNAは大きく減少しなかった。これは、リサイクル経路の阻害ではcccDNA量を減少させる効果が不十分であるか、リサイクル経路を介さないcccDNA維持機構が存在している可能性を示唆している。そこで本研究は、化合物スクリーニングから得られたcccDNA量を減少させる新規抗HBV低分子化合物のウイルスライフサイクルにおける作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持及び分解機序を解明することを目的とする。
2021年度は、ウイルスライフサイクルにおける低分子化合物の作用点を解析した。その結果、ウイルスの転写過程を抑制していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、新規抗HBV低分子化合物の作用機序を解析すると共に、cccDNAの維持および分解機序を解明することを目的としている。研究代表者は2020年度までに、作用機序の解析に有用なHBV感染感受性肝癌由来株化細胞(HepG2-hNTCP細胞)を作製し、ウイルスRNA、rcDNA及びcccDNAの解析法を構築した。また、cccDNAは宿主細胞核内においてミニクロモゾーム構造をとることで安定的に維持されていることから、cccDNA相互作用因子を解析する為にcccDNA画分の分離法を構築した。
2021年度は、低分子化合物のウイルスライフサイクルに対する作用点の解析を進めた。一般的にcccDNAの維持には、cccDNAから転写されたウイルスRNAが逆転写を経て新規cccDNAが作られるリサイクル経路が関わっていると考えられている。そこで、ウイルスRNAとその逆転写産物であるrcDNAに対する低分子化合物の抑制効果を検討した。その結果、化合物濃度依存的にウイルスRNA量と共にrcDNA量の減少が認められた。cccDNAからの転写は、HBx蛋白質が制御していることが知られている。そして、HBx蛋白質の発現はcccDNA上のEnhancer I/HBx promoter領域により制御されている。そこで、Enhancer I/HBx promoter配列をリポーター遺伝子の上流に連結したベクターを構築し、転写活性に対する低分子化合物の影響を検討した。その結果、低分子化合物濃度依存的なプロモーター活性の低下が認められた。以上の結果から、低分子化合物は転写活性を抑制することでHBxの発現を抑制し、cccDNA量の減少を導いていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
HBVは感染細胞の核内においてcccDNAが安定的に維持されることで持続感染化する。cccDNAの維持には「転写されたウイルスRNAがrcDNAへ変換され、再びcccDNAの供給源となる」リサイクル経路が提唱されている。研究代表者はこれまで、逆転写酵素阻害薬やHBV標的siRNAではrcDNAやウイルス蛋白質を効果的に抑制することは出来るがcccDNA量の減少を導くには不十分であるとの知見を得てきた。本研究は、cccDNA抑制効果が認められた蛋白質-蛋白質相互作用を特異的に阻害する低分子化合物の作用機序を解析すると共にcccDNA制御機序を解析することを目的としている。
2021年度までのウイルスライフサイクルにおける作用点の解析から、低分子化合物はcccDNA上のEnhancer I/HBx Promoterからの転写活性を抑制し、HBx mRNA量を減少させることでcccDNA量の減少を導いていることが示唆された。そこで2022年度は、cccDNAの維持と分解におけるHBx蛋白質の役割について解析を進める。また、タグを付加した低分子化合物の合成を試み、その標的因子を解析する。
高活性体取得を目指した低分子化合物の分子構造の最適化では、候補化合物の主骨格を維持したまま側鎖の官能基を置換した類縁体を合成することでcccDNA抑制活性に必須な側鎖を解析し、同定してきた。一方、主骨格は側鎖間の角度を決定している。そこで、主骨格分子構造を改変した類縁体の合成を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年度は、新型コロナウイルス感染症の影響で研究遂行に遅延が生じた。2022年度は「今後の研究の推進方策」に従い、以下のように研究を進める。
１）cccDNAミニクロモゾーム構造にはHBxが含まれていることが報告されている。また、本研究において低分子化合物がHBxの翻訳に使われるmRNAの転写を低下させていることが示された。そこでHBx蛋白質に注目し、cccDNAの維持と分解機構におけるHBx蛋白質の役割について解析を進める。２）化合物の濃度依存的なHBx mRNAの転写産物の減少が認められたことから、Enhancer I/HBx Promoter活性に対する低分子化合物の作用機序の解析を進める。３）低分子化合物修飾体を合成することで標的因子の解析を進める。４）主骨格の分子構造を改変した類縁体の合成を試み、高活性体の取得を目指す。
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