研究課題
本研究では、がん抗原特異的なＴ細胞受容体（TCR）遺伝子を、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、ヒトiPS細胞の内在性TCR遺伝子座へノックインすることを目的とした。まず実験系を確立するために、ヒトT細胞白血病株Jurkat細胞を用いて実験を行い、導入したTCRを正しく発現させることに成功した。そこでiPS細胞でも同様に実験を行い、カセット交換法でTCR遺伝子をノックインすることができたため、T細胞へ分化誘導したところがん抗原特異的に細胞傷害活性を示すことが確認できた。さらにカニクイザルのがんモデルを作出するため、優性変異型p53CT、CDK4、活性化型KRAS(G12V)、テロメラーゼ逆転写酵素TERTの４つのがん関連遺伝子をドキシサイクリン誘導性に発現するトランスジェニック（Tg）サルの作製を行い、計４頭が出産した。このうち１頭の臍帯において、遺伝子導入のマーカーであるGFPとクサビラオレンジの蛍光が確認され、4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を得ることができた。併行してMHCホモサル由来の腫瘍細胞をMHCヘテロサルに移植し、腫瘍組織に浸潤したT細胞や、腫瘍細胞を繰り返し移植することで迅速に腫瘍細胞を拒絶するMHCヘテロサルの末梢血中T細胞からシングルセルレベルでTCRα鎖とβ鎖の遺伝子をセットで単離した。その中から出現頻度の高いTCR遺伝子セットを選択し、iPS細胞から再生したT細胞に遺伝子導入したところ、腫瘍細胞を殺傷できるTCR遺伝子を同定することに成功した。さらに免疫不全マウスに腫瘍細胞を移植したのち、TCR遺伝子を導入した再生T細胞を移入したところ、腫瘍の成長が抑えられ、マウスの延命効果が見られたことから、TCR遺伝子を導入した再生T細胞が、生体内でも抗腫瘍活性を示すことがわかった。
3: やや遅れている
本研究では、がん抗原特異的なTCR遺伝子を、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、内在性TCR遺伝子座へノックインするために、まずJurkat細胞を用いて実験を行い、導入したTCRを正しく発現させることに成功した。そこでiPS細胞でも同様に実験を行ったが、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインはできたが、カセット交換ができなかった。カセット交換が起きるとPuromycin耐性遺伝子がPGKプロモーターにより発現するが、そのプロモーター活性がiPS細胞では低い可能性が考えられた。そこでPGKプロモーターを、iPS細胞で活性が高いことが知られているEF-1αプロモーターと交換したところ、再現性よくカセット交換ができるようになった。さらに４つのがん関連遺伝子をドキシサイクリン誘導性に発現するトランスジェニック（Tg）カニクイザルの作製を行い、２頭が出産した。他のTgサルと比較して妊娠効率が低いことから、レンチウイルスベクターを改良し、改良ウイルスを用いてTgサルの作製を行い、さらに２頭が出産した。このうち4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を１頭得ることができたが、産出されたサルに適切な時期（1歳半から2歳頃を予定）にプログラムポンプを埋込み、ドキシサイクリンの投与により腫瘍が発症するか検討を開始することができず、やや研究に遅れが生じている。併行してMHCホモサル由来の腫瘍細胞をMHCヘテロサルに移植し、腫瘍組織に浸潤したT細胞などからTCR遺伝子を単離し、レパートリー解析を行い、高い出現頻度を示すTCR遺伝子を同定することができた。これらのTCR遺伝子をT細胞へ導入する実験を試みたが、効率よく遺伝子を導入することが困難であり、方法の改善をはかるのに時間がかかったため、やや研究に遅れが生じた。
iPS細胞でも薬剤耐性遺伝子のプロモーター交換により、再現性よくカセット交換ができるようになり、TCR遺伝子を内在性TCR遺伝子座へノックインすることができたため、T細胞へ分化誘導したところがん抗原特異的に細胞傷害活性を示すことが確認できた。そこでTCR遺伝子をノックインした再生T細胞が、生体内でも抗腫瘍活性を示すか検討する。具体的には、免疫不全マウスに腫瘍細胞を移植したのち、TCR遺伝子をノックインした再生T細胞を移入し腫瘍の成長が抑えられるか、さらにマウスの延命や治療効果が見られるか解析を行う。カニクイザルのがんモデル作製では、これまでに計４頭の産仔が得られ、このうち１頭の臍帯において、遺伝子導入のマーカーであるGFPとクサビラオレンジの蛍光が確認されるとともに、4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を得ることができた。引き続き充分な産仔数が得られるまで作製を続けるとともに、Tg陽性の１頭が、令和３年度にドキシサイクリンを連続投与するためのプログラムポンプを埋込むのに適切な1歳半から2歳になることから、ドキシサイクリンの投与により腫瘍が発症するか検討を開始する。腫瘍発生には時間がかかると予想されることから、ポンプを埋め込む前から生検した皮膚組織等を培養し、ドキシサイクリンにより腫瘍化しないか検討する。
がん抗原特異的なTCR遺伝子を、ゲノム編集とカセット交換法を用いて、iPS細胞の内在性TCR遺伝子座へノックインを行ったがカセット交換ができなかった。薬剤耐性遺伝子のプロモーターを改良することによって、カセット交換ができるようになったが、その原因解明と方法改善のために研究の遂行に遅れが生じた。さらに４つのがん関連遺伝子をドキシサイクリン誘導性に発現するTgカニクイザルの作製では、レンチウイルスベクターを改良してさらに２頭が出産した。このうち4つのがん関連遺伝子がゲノムDNAに挿入された産仔を１頭得ることができたが、産出されたサルにプログラムポンプを埋込み、ドキシサイクリンの投与により腫瘍発症するか検討開始することができなかった。以上の結果をふまえ今年度に計画していた以下の実験を引き続き次年度に実施することになったため。TCR遺伝子をノックインした再生T細胞が生体内で抗腫瘍活性を示すか、免疫不全マウスに腫瘍細胞を移植したのち、再生T細胞を移入し腫瘍の成長が抑えられるか、マウスの延命効果が見られるか検討する。カニクイザルのがんモデルでは、Tg陽性の１頭が、令和３年度にドキシサイクリン投与のためのプログラムポンプを埋込むのに適切な1歳半から2歳になることから、ドキシサイクリン投与により腫瘍が発症するか検討する。
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Molecular Therapy - Methods & Clinical Development
巻: 19 ページ: 250-260
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Sci Rep.
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http://www.shiga-med.ac.jp/~hqbioch1/
