| 研究課題/領域番号 |
18K07248
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
西川 裕之 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 研究技術員 (90387077)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | DNA修復 |
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| 研究実績の概要 |
当初計画に従って、DSB時におけるBAP1相互作用因子の網羅適解析を行った。
免疫沈降-液体クロマトグラフィ-タンデムマススペクトロメトリー (IP-LC-MS/MS)法を用いて実験を行った。培養細胞に目的遺伝子(BAP1) を導入してタンパク質を発現させた。タンパク質同士の結合を保ちながら核及び クロマチンタンパク質を可溶化する為に細胞溶解には150mM以下の塩濃度に調製した溶解液に低温下で機能するエンドヌクレアーゼ(ベンゾナーゼ)を用いて実験を行った。放射線照射又は薬剤にてDSBをおこさせ又はコントロールとしてDSBさせていない細胞を溶解しBAP1に結合するタンパク質を免疫沈降し直接プロテアーゼ処理して複合体の混合ペプチドを作成した。作成したペプチドをLC-MS/MSにて分析し質量データを得た。この混合ペプチドの質量データをMATRIX Science社のMASCOT 及びX!Tandemの2つのプログラムを用いてデータベース検索し結合タンパクを複数同定した。また実験の再現性を確保する為、細胞種を変更し複数回の検討を行った所特定のタンパク質が繰り返し検出された。相互作用のあったタンパク質を同定した後、SCAFFORDソフトウェアにて一覧、数値化してIPAソフトウェアにて解析を行った。 IPAでの解析により、複数の機能に関わるパスウェイが同定された。
また幾つかは発表されていないパスウェイで有った。今回の検討で転写制御，細胞質分裂，細胞増殖など既知のパスウェイ以外でDNA修復に関わる新たなタンパク質に着目し、BAP1に対する翻訳後修飾関連のタンパク質について幾つか同定ができたので、それらの役割を今後解明したいと考える。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初計画通りにBAP1との結合タンパク質を同定する事が出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
BAP1結合タンパクがどのような役割を担っているか、当初計画通りに検討を行う。
また、新規結合タンパクを新たに発見する為に今後も質量分析を用いて検討を継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
想定していたよりも質量分析での検討回数が少なく、結果が得られた為。
残額は次年度も同様に質量分析を用いた相互作用因子の探索を行い、BAP1のDNA修復時の役割を解明したい。
また、金銭的余裕が有る為当初計画には無いBAP1結合タンパク質の機能解析も検討する。
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