| 研究課題/領域番号 |
18K07285
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
太田 里永子 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 研究員 (30452460)
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| 研究分担者 |
葛島 清隆 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍免疫応答研究分野, 分野長 (30311442) [辞退]
今井 優樹 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (30440936)
岡村 文子 (出町文子) 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍免疫制御TR分野, 主任研究員 (10546948)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | T細胞受容体 / 親和性の成熟 / がん特異的TCR |
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| 研究実績の概要 |
TCR（T細胞受容体）の親和性の成熟をin vitroで行う方法として、ファージディスプレイ法があるが、もともとTCRは抗体に比べて、抗原との親和性が低く、そのため、抗原へのきわめて高精度な特異性があっても、一価での親和性が低いTCRでは、ファージディスプレイ法による親和性の成熟は困難であった。
そこで、ファージディスプレイ法に代わる新たな親和性の成熟方法として、「293T細胞ディスプレイ法」を考案した。
293T細胞ディスプレイ法を用いて、がん抗原hTERTに対する野生型のTCRα鎖とβ鎖の抗原認識部位（相補性決定領域、CDR）にランダムに変異を導入したライブラリーを作成した。セルソーターを用いて、MHCテトラマー試薬に反応性の良い集団を２回分取し、その後クローニングを行い遺伝子配列の解析を行った。MHCテトラマーに反応性の強いクローン間で、特定の部位のアミノ酸の集積している傾向が確認できた。
各ライブラリーで反応性の最も良いクローンの配列を、野生型のTCRの配列に一つずつ戻し、どのアミノ酸が親和性の増強に重要か解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
hTERT TCRのβ鎖のCDR1とCDR2に変異を入れたライブラリーを用いて、MHCテトラマーに反応性が集団をソーティングした。３回ソーティングの後、クローニングを行い、遺伝子解析の結果、CDRにストップコドンが入ったクローンが増えてきている事が判明した。このことから、細胞培養と遺伝子導入、セルソーティングを２回以上繰り返すと、エラーの起きた細胞集団が増えてしまう可能性があるため、我々は一つのライブラリーからのソーティングは２回までとした。
クローニングの後、野生型のTCRと比較して、34個のMHCテトラマーに反応性のよいクローンが取得できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
得られたクローンのTCRを大腸菌のリコンビナントタンパク質として作成し、抗原との結合力をBiacoreにて評価する。
また、得られたクローンを、CD8I-J2細胞に発現させ、TCRが機能的かどうかを検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
計画していた一部の実験が行えず、試薬を購入しなかったため。
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