| 研究課題/領域番号 |
18K07317
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大津 直樹 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教 (10588403)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | グリオブラストーマ / 人工グリオブラストーマ幹細胞 / Eva1 / ゲノム編集 / 増殖抑制 |
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| 研究実績の概要 |
我々がこれまでに解析してきたEva1遺伝子は正常脳組織では発現しないが、治療抵抗性が強く再発の原因となるグリオーマ幹細胞おいて特に強く発現することが認められていた。そこでゲノム編集技術を用いてeva1遺伝子のプロモーター領域下流にGFP遺伝子を挿入すれば、Eva1陽性グリオーマ幹細胞を識別することができ、またp53などの増殖抑制遺伝子を挿入すればグリオーマ幹細胞の増殖を抑制できると考えられた。この計画に従い前年度はMCF細胞やT47D細胞のようなEva1が発現している細胞にゲノム編集ベクターと共にGFP遺伝子を導入するとGFP陽性Eva1陽性細胞を検出することができていた。またマウスにおいて、ゲノム編集でp53をノックアウトさせた神経幹細胞のEva1遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子であるmKO1を挿入した細胞を作成した。そこに活性化Rasを導入した人工グリオーマ幹細胞(NSCL61)におけるEva1遺伝子の発現とレポーター遺伝子の発現を解析していた。Eva1陽性細胞にmKO1陽性細胞の発現を検出していたが割合が低かった。そこで当該年度はゲノム編集でレポーター遺伝子が挿入されている細胞をクローニングした。そして活性化Rasを導入するとmKO1陽性の細胞集団を検出できた。またゲノム編集を用いてEva1が発現しているMCF7やT47D細胞にGFPとともにp53を強制発現させるとGFPだけを挿入したときにと比較してGFP陽性細胞の割合が著しく低かった。またアポトーシス細胞の増加が確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゲノム編集を用いてレポーター遺伝子を挿入したでは活性化RASを強制発現させた場合、mKO1の発現割合が低いという問題があった。そこで今回のレポーター遺伝子を挿入したクローン細胞を用いて解析するとmKO1を発現している細胞数の増加が認められた。またMCF細胞やT47D細胞のようなEva1が発現しているヒト細胞株ではEva1遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子とともにp53を発現させるとGFPだけを挿入したものと比べてアポトーシスを起こす細胞が検出された。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子が組替えられた細胞をクローニングすることでmKO1陽性細胞の増加は認められたので、NSCL61にレポーター遺伝子とともにp53遺伝子を挿入する細胞増殖抑制実験を進める。レポーター遺伝子とともにp53遺伝子をp53ノックアウト神経幹細胞に導入し、組換え細胞をクローニングする。そして活性化Rasを導入したときのmKO1陽性細胞の割合やアポトーシスの割合を解析する。Eva1陽性のヒト細胞であるMCF7とT47Dと同様にヒトGBM細胞でもレポーターとともにp53をEva1プロモーター下流に挿入しレポーター発現細胞の割合やアポトーシスの誘導の割合を解析するヒトGBM由来細胞は遺伝子導入効率も悪いという問題点があるが、ヒトのコントロール細胞のようにアポトーシスの誘導を検出する。
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