| 研究課題/領域番号 |
18K07379
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
朴 雅美 近畿大学, 医学部, 講師 (70469245)
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| 研究分担者 |
佐藤 文孝 近畿大学, 医学部, 助教 (30779327)
萩原 智 近畿大学, 医学部, 講師 (40460852)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ピロリ菌 / アルツハイマー型認知症 / 細胞外小胞 |
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| 研究実績の概要 |
本年度はアルツハイマー型認知症(AD)モデルマウスであるAPP/PS1 トランスジェニックマウス（ADマウス）と野生型マウスにピロリ菌(HP)を長期感染させた際の認知症状や脳の炎症について研究した。
若齢（5週齢）と老齢（10～12ヶ月齢）の野生型(WT)及びADマウスそれぞれ（4群）にHPシドニー株を感染させ、3~5ヶ月後にY-mazeテストを実施し認知症レベルを調べた。その後、血液を採取し、ホルマリン灌流固定したのち脳と胃を回収したHP非投与の同一週齢マウスをコントロールとした（コントロール4群、全8群）。血液は遠心分離で血清を調整し、抗HP抗体、IgGサブタイプのELISAに使用した。IgGサブタイプを測定することでヘルパーT細胞のTh1/Th2バランスを調べた。脳、胃は組織切片を作成し各種の染色に用いた。
本研究では8群を比較したが、Y-mazeテストでは、老若でのみ差が認められた。若齢マウスでは老齢マウスに比べて有意に行動量、認知能が高かったが、±HP、WT vs ADマウスでは差がなかった。
すべてのHP感染マウスで抗HP抗体が存在しており、胃の組織切片でもHPの存在を確認できた。脳内にHPは存在していなかった。血液中のIgGサブタイプ測定ではTh2=G1とTh1=G2cの比をHP投与前後で比較した結果、投与群ではTh1優位となっていることがわかった。免疫が炎症の起こりやすい状態となっていることがわかった。また、脳での炎症状態をアストロサイトマーカーのGFAPとミクログリアマーカーのIba1の染色で調べた結果、若齢ではいずれも低かったのに対し、老齢ではHP+の群が非投与コントロールに比べて有意に増加していることがわかった。WT, ADでの差はなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ADマウスの繁殖が軌道に乗り、HP感染実験も実施できている。マウスHP感染モデルの脳で炎症性の細胞であるアストロサイトとミクログリアの活性化が起きていることが分かった。HP感染と認知症との関連において感染動物実験で明らかな差が出た初めてのデータであり、非常に重要な結果である。このメカニズムについては現在検討中であり、一つの可能性としてHPの産生する細胞外小胞（microvesicle:MV）の関与を考えている。培養したHPからMVを回収し、蛍光ラベルしたものをマウスに投与すると、主に肝臓に集積するが脳へも移行していることがわかった。MVにはmiRNAやタンパク質などが含まれているが、こういった物が脳内で炎症を誘起しているかどうかを今後調べていく予定である。
また、ヒト神経芽細胞腫を福井大学医学部の濱野忠則教授に提供して頂き研究も進んでいる。すなわち、Neuro2A（マウス由来）, M1C（ヒト由来）にHPシドニー株、HP-TN2株、大腸菌の3種の菌から調整したMVを処理した結果、HPから調整したMVが増殖能を低下させる事がわかった。
ADマウスでの研究に注力しているため、多発性硬化症（MS）モデルマウスに関しては、現時点では着手していない。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画書通りに研究を進める予定である。
認知試験に関しては、すでに差が得られない事がわかったことから、脳の炎症がHP感染で誘起されるメカニズム解明を中心に研究を進めていく。これはHPのMVの作用を調べると共に血清のサイトカインなどをELISA等で解析する予定である。培養細胞株を用いた研究においては、動物実験と合わせた検証を実施する。
また、HP感染では胃のpHが増加し栄養状態が異なることから、当初の計画通り、胃酸中和剤の持続投与によって脳の炎症状態などに類似の影響が起こるかどうかを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していたELISAキットを購入せず、抗体などを購入し自作したことで経費を削減することとなった。また、購入予定であった抗体の一部は手持ちのもので十分量だったものもあり、使用額を少なくすることが可能であった。また、購入を計画していたヒト神経芽細胞腫に関して、よりよい細胞を分譲で入手し得たことも経費を削減し得たことの一因となった。
今後計画しているメタボローム解析などは外注となるため、それらの費用としてあてることを計画している。
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