2021 年度実施状況報告書

ミクログリアはニューロンに接触して何をしているのか？―疼痛モデルによる解析―

研究課題

研究課題/領域番号	18K07394
研究機関	新潟医療福祉大学
研究代表者	八坂敏一新潟医療福祉大学, 健康科学部, 教授 (20568365)
研究分担者	栗原崇鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (60282745)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2023-03-31
キーワード	神経障害性疼痛 / 脊髄後角 / ミクログリア / 局所神経回路 / インターニューロン
研究実績の概要	疼痛とは、不快な情動体験であり、人や動物は痛みを起こすような刺激から逃れようとする。これは本来危険から身を守るために重要な感覚であり、不快ではあるが（不快であるがゆえに）生存には有益となる。しかし、慢性疼痛になると、本来の役割は失われ、患者はただ不快な痛みに晒され続け耐え難い状況に陥ることとなる。中でも神経障害性疼痛は通常の鎮痛薬が奏効しないことが多く、原因解明と新規治療法の開発が急務である。この病態の動物モデルでは、脊髄後角ミクログリアの増殖・活性化が重要であり、これまでミクログリアから放出される分子を対象とした研究が多く行われてきた。しかし、我々は脊髄後角において、増殖したミクログリアが約1割のニューロンに接触していることを観察した。この接触にどのような役割があるのかを調べるのが本研究課題の目的である。脊髄後角ニューロンは大きく分けると興奮性細胞と抑制性細胞である。これらのニューロンは全く反対の機能を有しているため、ミクログリアの接触に細胞特異性があるのかをまず調べた。抑制性ニューロンのマーカーであるPAX2の抗体を用いた免疫組織化学染色を行ったが、最初に結果を得た後、この方法で最も重要な抗体の特異性に疑問が生じた。そのため、まず抗体の特異性3種類の抗体の特異性を検証した。その結果、最初に用いた抗体は非特異的な染色像が多いこと、後に用いた抗体の特異性が高いことが確認できた。これらの結果から今年度は特異性の確認された抗体を用いて研究を行う予定であった。本研究には共焦点顕微鏡が必要であるが、研究代表者が2020年度より赴任した研究機関にはそれがなかった。そこで、以前所属していた佐賀大学の共同研究施設の共焦点顕微鏡を使用することとした。しかし、昨年度に引き続き新型コロナウイルス感染症の感染拡大による様々な行動規制により、それ以上の研究を行うことは難しい状況であった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由本年度は、これまでに行った抗体特異性の検討によって得られたデータの論文化や、特異性が確認できた抗体を用いて抑制性ニューロンとミクログリアとの接触を観察する実験を予定していた。本研究の実験は主に研究代表者によって行われているが、研究代表者は2020年度所属機関を移動した。しかし、現所属機関には、共焦点顕微鏡が設置されていない。そのことは事前に分かっていたため、他大学の共同利用施設の中で学外利用者も使用可能な施設で実験を行う予定としていた。中でも佐賀大学の共同利用施設は、研究代表者が以前佐賀大学に所属していたため、利用しやすく、外部の利用者の受け入れも行っている。当該施設の方とも打ち合わせを行い、利用可能であることも確認できた。しかしながら、新型コロナウイルス感染症の感染拡大を受けて、国内の移動や学外利用者の制限が設けられたため、共焦点顕微鏡による実験が不可能となった。また、現在の所属機関では教育業務、運営業務がこれまでに比べ大幅に増加し、研究に割り当てることができる時間も大幅に減少した。これらの理由により、研究の進捗状況は遅れを生じている。
今後の研究の推進方策	今後は、今年度に実施する予定であった以下の実験を実施する予定である。しかし、新型コロナウイルス感染症の感染拡大状況に大きく影響される恐れがある。先ず現在行っているミクログリアが接触しているニューロンが興奮性か抑制性かについて結論付ける。その結果、選択性が確認された場合、抑制性細胞ではニューロペプチドYやパルブアルブミン、ガラニン、カルレチニン、興奮性ではPKCγやカルレチニン、ニューロペプチドFF、ダイノルフィンといったサブグループのマーカーにより、より細かな選択性があるのかどうかを調べる。今回研究対象としているニューロンとミクログリアの接触はニューロンの細胞体で観察されているものである。もし、細胞体へのシナプス入力がある場合には、この接触によってシナプスが除去されるような変化が予想される。一般的にニューロンの細胞体には抑制性シナプスが主に存在し、興奮性のシナプスは少ないとされる。予備実験においても細胞体には抑制性シナプスのマーカーが主に観察された。そのため、本研究では抑制性シナプスに焦点を当てて検討することとする。これらのシナプスが、ミクログリアの接触することによって除去されていれば、抑制性シナプスのマーカーが減少するはずである。予備実験を行ったが、現在のサンプリングではZ軸方向の厚みが10ミクロンで、細胞体を全て網羅することが困難であるため、厚みのあるデータのサンプリングを行い、ニューロンとミクログリアの接触とシナプス数に間に関連性があるかどうかを定量的に調べる。
次年度使用額が生じた理由	【現在までの進捗状況】において「遅れている」理由として記したことであるが、研究代表者は2020年度所属機関を移動し、新型コロナウイルス感染症の感染拡大による様々な規制により、共焦点顕微鏡を用いた実験を行うことができなかった。また、教育業務の大幅に増加により、研究できる時間が大幅に減少した。これらの理由により、研究を予定通りに遂行することが困難であった。そのために次年度使用額が生じた。使用計画としては、共焦点顕微鏡を使用するための旅費・及び使用料が生じる予定である。前述したように、現在の所属機関に共焦点顕微鏡は設置されていないため、佐賀大学の共同実験施設を利用する予定である。新型コロナウイルス感染拡大防止の対策も緩和方向に転じているため、今年度は実施できることを期待している。他には主に消耗品であるが、染色に用いる試薬である抗体は単価が高いため、予算が必要である。