| 研究課題/領域番号 |
18K07402
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
笹栗 弘貴 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 副チームリーダー (10783053)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アルツハイマー病 / プレセニリン / アミロイドβ / 認知症 / モデルマウス / ゲノム編集 / 塩基編集 / ノックイン法 |
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| 研究実績の概要 |
アルツハイマー病（AD）は認知症の原因疾患として最多の疾患であり、原因不明の神経変性疾患である。プレセニリン１（PSEN1）遺伝子の変異は、常染色体優性遺伝形式を示す家族性ADにおいて最も頻度が高い原因遺伝子変異であり、これまでに300以上の変異が報告されているが、PSEN1変異によるAD発症のメカニズムは十分解明されていない。本研究課題では、最新のゲノム編集技術を駆使し、変異Psen1モデルマウスを複数系統作出した上で、詳細に生化学的・病理学的解析を行い、比較検証することで、特に脳内アミロイドβ（Aβ）産生プロファイルの異常とAD病態との関連に着目し、PSEN1変異によるAD発症の機序を解明することを目的とする。
2020年度は、前年度までに作製した複数の変異Psen1マウス系統を繁殖させ、生化学的解析に必要な脳試料を採取した。更に、Psen1変異の脳アミロイド病理への影響を評価するため、各変異Psen1マウス系統と、App遺伝子に家族性ADの原因となるSwedish変異を有するAppNLマウスとの交配、繁殖を行った。また、生化学的解析に利用するため、一部の変異Psen1マウス胎児から胎児線維芽細胞を樹立した。ELISAにより各遺伝子型の線維芽細胞の培養液中のAβ産生プロファイルを評価した結果、脳内と同様の変化を示していることが判明した。また、Psen1-P117Lマウスと、App遺伝子にSwedish変異とIberian/Beyreuther変異を有するAppNL-Fマウスと交配し、脳内アミロイド産生プロファイルおよびアミロイド病理を評価した。その結果、AppNL-Fマウスと比較して病的Aβ産生量およびアミロイド斑が著しく増加していることが判明した。
これらの研究成果は、2020年9月日本抗加齢医学会総会のシンポジウムの講演にて発表した。2020年度は原著論文の発表はない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Aβ産生プロファイルの異常とAD病態の関連を明らかにするという、本研究課題の最終的な目的を達成するため、2020年度は、前年度までに作製した複数の変異Psen1マウス系統を繁殖させ、生化学的解析に必要な脳試料の採取を行った。特にPsen1遺伝子によりコードされるPS1タンパクが主要な構成成分となるγセクレターゼの機能を評価するため、胎児脳試料の採取に加え、胎児線維芽細胞の樹立を行った。また、変異Psen1マウス系統をApp-KIマウスと交配し、一部の系統で脳内Aβ産生プロファイルやアミロイド病理の解析を行った。
Psen1-V94M、Psen1-P117Aの胎児線維芽細胞では、脳と同様のAβ産生プロファイルが再現されることが判明し、胎児線維芽細胞が生化学的解析に使用するにあたり、適切な試料であることが示された。また、Psen1-P117Lマウスと、App遺伝子に家族性ADの原因となるSwedish変異とIberian/Beyreuther変異を有するAppNL-Fマウスと交配した結果、AppNL-Fマウスと比較して病的Aβ産生量およびアミロイドプラークが著しく増加していることが判明し、PS1とAPPの遺伝子変異の効果は相乗的であることが示された。また、この結果から、変異Appノックインマウスと変異Psen1マウスの交配によって獲得される変異マウスが、脳内アミロイド病理の評価・解析に有用であることが確認された。
コロナウイルス感染症の影響で、マウスの交配・繁殖や胎児試料での生化学的解析など一部実験計画に遅延が生じているものの、2021年度の実験計画遂行に必要なマウス個体数や脳試料がそろいつつあり、本課題は概ね順調に進捗している。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は、ホモ接合型を含む変異Psen1マウス胎児脳組織や胎児線維芽細胞を用い、WBでPS1の発現量や断片化の評価、ELISAによるマウス脳のAβ40、Aβ42の産生パターンの評価を行う。また、γセクレターゼのAPP以外の基質であるNotch1レセプターの切断への影響を評価する。Notchレセプターは細胞分化や組織形成に関与する分子であり、一部のPsen1変異マウスはホモ接合型では胎生致死であることが知られている。これらの解析により、変異Psen1のAD病態への影響のみでなく、PS1の発達期における役割、および基質複合体形成を含むγセクレターゼの酵素反応の機序を検証できる。
アミロイド病理への影響を評価するため、内因性マウスApp遺伝子にSwedish変異を有するAppNLマウスや、Swedish変異に加えIberian/Beyreuther変異を有するAppNL-Fマウスと、各変異Psen1マウス系統の交配を継続し、適切な時期に脳試料の採取を行う。3か月齢で採取した脳試料に対して、ELISA、WBなどの生化学的解析を行い、各Psen1遺伝子変異によるAPPプロセシングおよびAβ産生プロファイルの変化を詳細に評価する。また、12か月齢を目標に脳試料を採取し、免疫染色によりアミロイド病理や神経炎症、タウ病理を評価する。
更に、一細胞解析を含むRNA配列解析により、脳部位ごとあるいは各年齢における、神経細胞やグリア細胞など細胞種ごとのPsen1変異の影響を評価する実験系の構築を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナウイルス感染症による出勤制限のため、実験に使用するマウスの交配、繁殖が予定通りにできず、マウス飼育費用が予定より少額となった。また、一部実験が行えなかった。すでに交配・繁殖は再開しているが、2021年度にサンプル採取のためのマウス個体数が多くなり、また生化学的・病理学的解析など、必要な実験も多くなっているため。
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