| 研究課題/領域番号 |
18K07432
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| 研究機関 | 姫路獨協大学 |
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研究代表者 |
通山 由美 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (70362770)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 好中球 / NETs |
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| 研究実績の概要 |
Neutrophil extracellular traps（NETs）は、好中球のクロマチンが弛緩して網状構造に変化し、病原微生物を一挙に捕捉する生体防御機構である。近年、NETs成分が血小板を刺激して血栓症を誘発することが新たな病態として注目されている。そこで本研究では、NETs形成の分子メカニズムの解明、血小板血栓を惹起するNETs成分の同定、さらに血栓症の早期診断法の開発を目ざす。具体的には以下の1）～3）の流れで研究を進める。1）質量分析法を活用して、NETs形成過程に特異的な翻訳後修飾を探索する。2）見いだした翻訳後修飾を含むタンパク質の変異型好中球モデルを作成してNETs形成への影響を解析する。3）血小板を刺激するNETs成分に対する抗体を作成する。
平成30年度は、ヒト好中球にNETs形成を誘導し、経時的に網羅的な質量分析（iTRAQ法）をおこなった結果を解析した。NETs形成プロセスで有意に変動する翻訳後修飾を含むタンパク質としてP4HBを見いだした。P4HBは、ジスルフィドイソメラーゼ (PDI)ファミリータンパク質に含まれ、ジスルフィド結合の形成や再構築に寄与する。P4HBのNETs形成における役割を明らかにするため、遺伝子編集技術（CRISPR/Cas9）を利用して、P4HBノックアウト（KO）型HL60細胞（好中球様に分化できるヒト白血病細胞株）の作成に取り組み、4種類のP4HB-KO型HL60細胞を樹立した。これらP4HB-KO細胞を、好中球様に分化誘導し(ATRA刺激後４日間培養)、P4HBノックアウトによる分化への影響を解析したところ、分葉核の形成および細胞表面のCD11bCD18の発現量には差異が認められなかった。今後は、NETs形成を中心に、好中球の機能への影響について解析を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
順調な点は、NETs形成過程における網羅的な質量分析の結果を分析して、新たに標的分子を決定し、遺伝子編集技術（CRISPR/Cas9）を利用して、標的分子のノックアウト（KO）型好中球モデルを樹立できたことである。一方で、NETs成分による血小板の活性化プロセスの解析方法の確立については次年度の新たな課題である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度の実績として、NETs形成過程に特異的な翻訳後修飾を含むタンパク質として、ジスルフィドイソメラーゼ (PDI)ファミリータンパク質、P4HBを見いだし、そのノックアウト型好中球モデル（P4HB-KO型HL60細胞）を樹立した。今年度は、P4HB-KO型HL60細胞について好中球の機能における影響について解析をおこなう。具体的には、好中球様分化後のNETs形成プロセス、活性酸素種の産生量、補体を介した食作用および細胞遊走能などについて解析する。その際、先行して標的分子として同定し、すでにノックアウト型好中球モデルを樹立した３種類のタンパク質（プロテインS100-A8、 プロテインS100-A9、チロシンキナーゼ、Syk ）のKO型HL60細胞の結果と比較しながら検討を進める。
さらに、ヒト好中球のNETsが、ヒト血小板の活性化(凝集)を誘導するプロセスを定性的、定量的に解析する方法を検討する。確立した血小板活性化（血小板凝集）の解析方法を利用して、好中球様に分化した野生型 HL60細胞によるNETs、およびP4HBを含む４種類の標的分子のKO型HL60細胞由来のNETsによる血小板活性化（血小板凝集）の誘導について、強度および要する時間や凝集の形態などを解析する。血小板の活性化を減弱する標的分子の KO型HL60細胞ついては、レスキュー細胞の作成を試みてその効果を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品費、とりわけ抗体および遺伝編集に必要な試薬類を予定より少量ですませることができ、予算に余裕が生じた。今後はその費用を、標的分子のノックアウト型好中球モデルの機能解析に必要な試薬、およびNETs成分による血小板凝集の計測と観察に必要な物品の購入のために有効に利用する。
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