| 研究課題/領域番号 |
18K07433
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
宮本 泰豪 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 総括研究員(分子生物学部門長) (90322742)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 腫瘍マーカー / 糖鎖 / 質量分析 |
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| 研究実績の概要 |
申請者は本研究では、申請者たちが見出した異性体を含む多種類の糖鎖腫瘍マーカー群を、質量分析の Selected reaction monitoring (SRM)法により、高精度、高感度、多項目同時測定する技術の確立を目指している。
当該年度は、SRMのフロント部分、すなわち高速液体クロマトグラフィー(HPLC)での多種類の糖鎖マーカー群を分離する技術の改良を行った。従来は、nano-HPLC (流速 2micro liter/ min、0.2mm X 50mm系のミクロカラムを使用)を用いての逆相クロマトグラフィーでの分離を行っていた。検出限界が0.5fmolと感度は十分であることは確認できたが、ターゲットとする糖鎖マーカー候補群、特に異性体同士では分離能が極めて低いため、同じ時間に溶出され、分離できる条件を見出すことが困難であった。そこでフロント部分をconventional HPLCに変更し、流速、カラムの系、溶出溶媒などの最適条件を詳細に検討した。現時点では、流速 50micro liter/min、1mm X 35mm系の逆相系のセミミクロカラムを使用し、A溶液：5mM 酢酸トリエチルアミン pH 6.0、B溶液：50% アセトニトリルを使用した場合が、もっともよい結果が得られた。感度は検出限界が5fmolと、nano-HPLCに比して１桁程度低下した。一方で、ターゲットとする糖鎖群が幅広い分離条件において、分離できる可能性が示唆された。グラファイトカーボンカラムは、逆相系に比して、糖鎖の分離能には優れてたが、シアル酸が２つ以上付加された糖鎖や、シアル酸と硫酸が両方付加された糖鎖がアセトニトリルなどの有機溶媒の濃度をあげても溶出されず、使用は困難と判断した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度に実施した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の技術の改良は、本研究目的である多種類の糖鎖腫瘍マーカー候補をSRMで測定するために必要な技術であり、実施計画に沿ったものである。目標達成に向けて、着実に前進していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度の研究から、従来使用していたnano-HPLCより、conventional HPLCを用いて、セミミクロカラムで分離するほうが、多種類の糖鎖腫瘍マーカー群を一度に分離できる可能性が示唆された。今後は、現在利用している逆粗のカラムの他に、順相カラム、ガラファイトカーボンカラムなど、多種類のものを比較検討する必要がある。
さらに、conventional HPLCでは、nano-HPLCに比して感度は１桁低下するが、流速や、イオン化条件を再検討して、改善策を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は予測以上に消耗品の支出が少なくてすんだ。さらに、研究を遂行する上で、高価な備品などを購入する必要がなかった。
次年度には、HPLC用のカラム、酵素類、チューブ類などの消耗品の購入、学会での成果発表のための旅費などに使用する計画である。
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