研究課題
本研究の目的は，臨床的に血液脳関門(blood-brain barrier: BBB)/血液神経関門(blood-nerve barrier: BNB)破綻が発症・増悪の契機となることが明らかな自己免疫性神経疾患患者検体から，BBB/BNBを破綻させる自己抗体の新規標的分子を同定し，今まで新規医薬品として開発された事の無い，BBB/BNBを人為的に操作しうる画期的な新規モノクローナル抗体を開発することである．これまでに申請者らは世界に先駆けてヒト由来のBBBとBNBを構成する内皮細胞とペリサイトの温度感受性条件的不死化細胞株を複数樹立した (J Cell Physiol 2008, 2010, 2011)．申請者は多数の患者血清から精製した免疫グロブリンG (IgG)からBBBに生物学的活性を有するIgGを同定するハイコンテントイメージングシステムと患者IgGが結合する生細胞表面に発現する抗原を同定するプロテオーム解析法を確立した．本年度は，約300検体以上の急性期および安定期の視神経脊髄炎，多発性硬化症，自己免疫性脳炎，ギラン・バレー症候群，慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー患者血清からIgGを精製し，BBB/BNB構成血管内皮細胞に作用させ，NF-κB/ICAM-1の免疫染色をベースとしたハイコンテントイメージングシステムを用いて生物学的活性をもたらすIgGの同定を試みた．複数の患者IgGでBBB/BNB血管内皮を活性化することを明らかとした．特に小脳失調を伴うランバート・イートン筋無力症患者血清由来のIgGがBBB血管内皮細胞のNF-κB核内移行を促進させ，ICAM-1の発現を増加させ，強い生物学的活性があることを明らかとした．
2: おおむね順調に進展している
2018年度は多数の神経免疫疾患患者血清からBBB/BNBに生物学的活性を示すIgGを同定するためのハイコンテントイメージングシステムを確立した．このシステムはNF-κB，ICAM-1を免疫染色し，In cell analyzer 2000を用いて96ウェルプレート1枚で多検体を同時に，1ウェル毎1000細胞以上カウントし，NF-κB p65核内移行率とICAM-1強陽性細胞率を定量化できるhigh throughputなシステムである。更に，生物学的活性を有すると確認されたIgGがBBB/BNBのバリアー機能を破綻させるかを検証し，tight junction関連蛋白であるclaudin-5の蛋白量と10kDa-dextran/130kDa-dextran透過性が低下することを証明した．更に，同定されたIgGとBBB/BNB構成血管内皮細胞を用いてプロテオーム解析をし，これらのIgGに対する新規免疫標的分子を同定する同定されたIgGとBBB/BNB構成血管内皮細胞を用いてプロテオーム解析をし，これらのIgGに対する新規免疫標的分子を同定するアッセイの確立を試みた．ディッシュ上で生細胞に患者IgGを結合させ，クロスリンカーで固定させた後に蛋白を抽出しプロテインA/Gカラムを用いてIgGと結合した抗原を単離し，得られた抗原蛋白を2次元電気泳動，質量分析法により同定するアッセイ系確立のための研究を進めた．研究は当初の計画通り順調に進んでいる．
2019年度は生物学的活性のある患者IgGとBBB/BNB構成血管内皮細胞を用いてプロテオーム解析をし，これらのIgGに対する新規免疫標的分子を同定する研究を進める．新規標的分子が同定できれば，次に患者IgGから新規標的分子に対する自己抗体を除去し，その生物学的活性が低下するかを検討する研究を進める．具体的には，新規標的分子とコントロール蛋白のタグ（FLAG）融合蛋白質を合成し，患者IgGと健常成人IgGを反応させ免疫複合体を形成させ，次にアガロースレジンに共有結合したAnti-FLAG affinity gelを加え免疫沈降させる．上清を回収することで患者IgGから標的分子に対する抗体を除去したIgGが採取でき，得られたIgGが生物学的活性を失っているかをハイコンテントイメージングシステムにより定量的に評価する．可能であれば，標的分子に対するモノクローナル抗体を新たに作製し，microfluidic in vitroモデル，動物モデルでの有効性を検討する研究も進める．具体的には，Nortis BioあるいはMimetusのMicrofluidicチップを用いて，ヒトBBB/BNB由来血管内皮細胞を管腔側に播種し，ペリサイトおよびアストロサイトをコラーゲンゲル下で3次元培養し，BBB/BNBモデルを形成する．流速負荷中でこのBBB/BNBモデルに作製したモノクローナル抗体を作用させ，ラベルしたIgG, 10kDa-/130kDa-dextranの透過性変化をリアルタイムかつ定量的に測定する．複数作製した新規標的分子に対するモノクローナル抗体の中で，最も生物学的活性を有するものを同定する．最後に，健常マウスあるいはラットに標的分子に対するモノクローナル抗体を経静脈的投与し，BBB/BNBの透過性が亢進するかを解析する．
免疫染色のための最適な抗体を探しており，本年度は購入を控えた．来年度に抗体を新たに２個購入する予定である。
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J Neurol Neurosurg Psychiatry
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