疾患特異的iPS細胞を用いたポリグルタミン病創薬スクリーニングシステムの開発

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07539
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 丹羽 淳一 愛知医科大学, 医学部, 教授 (50378022)
• 研究分担者: 岡田 洋平 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (30383714) ; 伊藤 卓治 愛知医科大学, 公私立大学の部局等, 客員研究員 (30794151)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 疾患特異的iPS細胞 / ポリグルタミン病 / 創薬スクリーニング / 球脊髄性筋萎縮症

研究実績の概要

(1)解析に用いるSBMAモデル細胞の作製：前年度までに全長AR24Q（正常型）または AR55Q, AR97Q（変異型）を定常発現するヒト骨格筋細胞株（Hu5/E18）を作成していたが、この細胞だと筋収縮などの機能的な側面からは生理的骨格筋とは大きく異なることを見出した。そこで、筋収縮を確認できたヒト骨格筋細胞であるHu5/KD3を用いて、AR24Q（正常型）または AR55Q, AR97Q（変異型）を定常発現するヒト骨格筋細胞株し、ウマ血清存在下で筋管を誘導し得ることを確認した。導入した変異ARの発現と凝集体形成、筋収縮等について解析を進めている。
(2)内在性伸長ポリグルタミン鎖を可視化し得る新規プローブの作成：前年度までに、正常ポリグルタミン鎖（正常CAGリピート数）をもつtruncate AR24QとEmGFPの融合タンパク （tAR24Q-EmGFP）を、伸長ポリグルタミン鎖をもつ全長AR（AR-97Q）とともに細胞に導入することで、全長ARによる凝集体形成を可視化し得ることを確認した。しかし、truncateAR24Qであっても、高発現すると病態に影響し得ることから、より毒性の低いプローブをデザインし、現在作成を進めている。
(3)疾患特異的iPS細胞を用いた検討：疾患特異的iPS細胞から運動ニューロンを誘導し、表現型を検出するための成熟培養法や培養条件を確立した。また、ストレスを負荷することで、表現型が促進することを見出した。一方、iPS細胞から骨格筋を分化誘導し、成熟分化を促進する培養法を開発し、疾患特異的iPS細胞由来骨格筋の表現型解析を進めている。今後、このようにして疾患特異的iPS細胞から誘導した運動ニューロンや骨格筋に（1）で開発したプローブをレンチウイルスにより導入し、その評価を進める予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ヒト骨格筋細胞株を用いた解析では、病態を再現し得る適切な疾患モデルの作成が進んでいる。また、疾患特異的iPS細胞を用いた疾患モデルの作成も進めており、iPS細胞から誘導した運動ニューロンと骨格筋の成熟促進法、表現型を検出するための最適な運動ニューロンの培養条件を見確立した。今後、作成したプローブの評価に応用できると考えられる。一方、より効率的に凝集体を可視化し得るプローブについては、デザインは完了しているが、その作成が滞っており、予定より遅れている。

今後の研究の推進方策

より効率的に凝集体を可視化するプローブの作成を進め、作製した疾患モデル細胞を用いて評価していく。また疾患特異的iPS細胞によるモデルを用いた評価も進めていく予定である。

次年度使用額が生じた理由

効率的な研究費の使用により、次年度使用額が生じた。翌年度分と合わせて、実験試薬や実験器具等の消耗品の購入、研究技術員の雇用等に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Two distinct mechanisms of neuropathy in immunoglobulin light chain (AL) amyloidosis (2021)
  • 著者名/発表者名: Koike H, Mouria N, Fukamia Y, Iijima M, Matsuo K, Yagi N, Saito A, Nakamura H, Takahashi K, Nakae Y, Okada Y, Tanaka F, Sobue G, Katsuno M
  • 雑誌名: Commun Biol. 巻: 421 ページ: 117305
  • DOI: 10.1016/j.jns.2020.117305.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selective suppression of polyglutamine-expanded protein by lipid nanoparticle-delivered siRNA targeting CAG expansions in the mouse CNS. (2021)
  • 著者名/発表者名: Hirunagi T, Sahashi K, Tachikawa K, Leu AI, Nguyen M, Mukthavaram R, Karmali PP, Chivukula P, Tohnai G, Iida M, Onodera K, Ohyama M, Okada Y, Okano H, Katsuno M.
  • 雑誌名: Mol Ther Nucleic Acids. 巻: 24 ページ: 1月10日
  • DOI: 10.1016/j.omtn.2021.02.007.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Development of a Human Neuromuscular Tissue-on-a-Chip Model on a 24-Well-Plate-Format Compartmentalized Microfluidic Device (2021)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto K, Yamaoka N, Imaizumi Y, Nagashima T, Furutani T, Ito T, Okada Y, Honda H, Shimizu K
  • 雑誌名: Lab on a Chip 巻: 21 ページ: 1897-1907
  • DOI: 10.1039/d1lc00048a.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modulation of oxygen tension, acidosis, and cell density is crucial for neural differentiation of human induced pluripotent stem cells. (2021)
  • 著者名/発表者名: Okada R, Onodera K, Ito T, Doyu M, Okano HJ, Okada Y
  • 雑誌名: Neurosci. Res. 巻: 153 ページ: 34-42
  • DOI: 10.1016/j.neures.2020.01.015.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A multi-ethnic meta-analysis identifies novel genes, including ACSL5, associated with amyotrophic lateral sclerosis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakamura R, Misawa K, Tohnai G, Nakatochi M, Furuhashi S, Atsuta N, Hayashi N, Yokoi D, Watanabe H, Watanabe H, Katsuno M, Izumi Y, Kanai K, Hattori N, Morita M, Taniguchi A, Kano O, Oda M, Shibuya K, Kuwabara S, Suzuki N, Aoki M, Ohta Y, Yamashita T, Abe K, Hashimoto R, Aiba I, Okada Y, Nagasaki M, Sobue G. et al.,
  • 雑誌名: Commun Biol. 巻: 23 ページ: 526
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01251-2.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] n vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagashima T, Hadiwidjaja S, Ohsumi S, Murata A, Hisada T, Kato R, Okada Y, Honda H, Shimizu K
  • 雑誌名: Adv Biosyst. 巻: 11 ページ: e2000121
  • DOI: 10.1002/adbi.202000121.
  • 査読あり
• [学会発表] 疾患iPS細胞を用いた運動ニューロン疾患の病態解明と治療開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 第19回日本再生医療学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 末梢神経障害の機能再建におけるヒトiPS細胞の可能性と問題点 (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 第31回日本末梢神経学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 疾患特異的iPS細胞を用いた神経・筋病態の解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡田洋平
  • 学会等名: 第6回日本筋学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Drug screening for early pathology of SBMA using disease specific iPSCs and novel biomarkers (2020)
  • 著者名/発表者名: エルクラノ ブルーノ、小野寺一成、伊藤卓治、下門大祐、岡田梨奈、勝野雅央、道勇学、祖父江元、岡野栄之、岡田洋平
  • 学会等名: 第19回日本再生医療学会
• [学会発表] 疾患iPS細胞による神経・筋共培養を活用した神経変性疾患の病態解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊藤卓治、小野寺一成、下門大祐、田中智史、岡田梨奈、ラシッド ムハンマド イルファヌール、道勇学、岡野栄之、岡田洋平
  • 学会等名: 第19回日本再生医療学会
• [学会発表] Efficient and reproducible skeletal muscle differentiation from iPSCs for muscular diseases modeling (2020)
  • 著者名/発表者名: ラシッド ムハンマド イルファヌール、伊藤卓治、小野寺一成、道勇学、岡田洋平
  • 学会等名: 第19回日本再生医療学会
• [学会発表] Elucidation of early pathophysiology of spinal-bulbar muscular atrophy using disease- specific iPSCs. (2020)
  • 著者名/発表者名: Onodera K， Shimojo D，Yoda M, Ishihara Y， Ota A, Yano M, Miya F, Rashid MI, Ito T, Okada R, Tsunodna T, Hosokawa Y, Doyu M，Katsuno M， Okano H， Sobue G， Okada Y.
  • 学会等名: 第61回日本神経学会学術大会