| 研究課題/領域番号 |
18K07615
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
窪田 美恵 (坂下美恵) 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 専門職研究員 (90344035)
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| 研究分担者 |
島 康之 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 上級研究員 (60815885)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 酸化ストレス / ミトコンドリア / モノアミンオキシダーゼB / モノアミン / 気分障害 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までにCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いて作成した、Maob ノックアウトマウス、およびMaob flox/floxマウス（Creを発現する細胞のみでMaobがノックアウトされるマウス）を用いて、脳内モノアミン量、およびその代謝物へのMaobノックアウトの影響を観察する目的で、質量分析での測定方法を確立した。現在、Maob遺伝子の大規模欠損マウスを用いて、ドーパミン、セロトニン、ノルアドレナリンなどのモノアミン、およびその代謝物の変化を観察した。目的とする神経核はMAObを多く発現する縫線核、視床室傍核、および、腹側被蓋野に加えて、それらの投射核である、側坐核、島皮質、視床下部、線条体である。これらの極めて小さい領域について、マイクロウエーブ固定した脳を1-2mm厚でスライスし、生体パンチにより摘出した。特に視床室傍核の組織重量は、1匹当たり直径1mmのパンチ1個分に相当し、約1mgである。MAObの基質であるフェニルエチルアミン（PEA）の脳内濃度は非常に薄いことが知られている。そのため、野生型ではPEAの含有量は非常に少なかったが、ノックアウトマウスでは、野生型に対し、PEAが増加している傾向が示唆された。今後、適切な週令のペアを用いて、野生型とノックアウトマウスとの比較し、検量線を用いて、定量測定を行う予定である。
また、リアルタイムPCR法により、Maob遺伝子がノックアウトされていること、およびCRISPR/Cas9による非特異的な遺伝子の欠失などがないことを確認するため、ノックアウトマウス脳からRNAを抽出し、定量PCRを行うためのプライマーセットのデザインと方法の確立を行った。Maob遺伝子の近傍に存在するMaoa遺伝子、Ndp（Norrie disease pseudoglioma）遺伝子についてその発現量を比較する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
非常に小さな神経核からのモノアミン測定は困難であると予想されたが、Maob 遺伝子の大規模欠失マウスでは、視床室傍核においても、測定可能であることが判明した。また、野生型に存在するPEA濃度に対し、ノックアウトマウスにおいては、増加傾向にあり、再現性が取れている。今後、検体数を増やして、妥当性を検証する予定であるが、測定方法が確立し、絶対定量が可能になった。また、Maob遺伝子のノックアウトの検証のため、定量的PCRでの確認を進め、現在、RNAの抽出とプライマーデザインまで終了した。近傍の遺伝子に異常がなければ、今後、このマウス系統を用いて、酸化ストレスの変化や各神経核におけるイメージング質量分析によるモノアミン分布の違いなどを検討できるようになるため、順調に進んでいると考えられる。。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）Maobノックアウトマウスにおける脳、および血漿中モノアミン量の定量ー質量分析法により、一度に測定できることが確認できたモノアミン類の代謝物は、5-ヒドロキシインドール酢酸と3-メトキシチラミンであった。セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン、PEAにこの代謝物を加えた7化合物を測定する。既知濃度の標準物質を添加したサンプルを用いて、検量線を用意し、相対定量を行う。
2）MaobノックアウトマウスにおけるMAOb遺伝子発現量の確認ー嗅球、視床室傍核、縫線核、小脳、肝臓、小腸より、Trizolを用いてRNAを抽出し、逆転写によりcDNAを合成し、リアルタイムPCR法を用いて、ベータアクチン遺伝子の発現量に対する相対的定量を行う。、Maob遺伝子ノックアウトによる隣接した遺伝子への影響の確認（Maoa遺伝子、Ndp（Norrie disease pseudoglioma）遺伝子）も同じ方法で行う。
3）Maobノックアウトマウスにおけるイメージング質量分析法を用いたモノアミン類の分布の検討ー1)の方法では、その組織あたりについて、モノアミン類の含有量を測定できるが、脳の他の部位における分布を観察することはできない。そのため、脳切片上のモノアミン類の分布の違いを網羅的に観察するため、イメージング質量分析法を用いる。
4）視床室傍核特異的なノックアウトを行うための実験系の確立ーMaob flox/floxマウスにウイルスベクターを投与した後の確認方法の検討を行う。灌流固定後の脳組織より切片を作成し、Maob抗体による染色を行い、野生型との比較によって、視床室傍核では陽性細胞数が低下し、縫線核においては陽性細胞が維持されていることを確認する。大規模欠失マウスにおいても、Maob抗体を用いた免疫組織化学的染色を行い、その違いを確認する。
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