| 研究課題/領域番号 |
18K07768
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (30524243)
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| 研究分担者 |
小川 良平 富山大学, 学術研究部医学系, 准教授 (60334736)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞死 / アポトーシス / ネクローシス / リアルタイムイメージング / 放射線治療 |
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| 研究実績の概要 |
細胞死は，形態的特徴から古典的にアポトーシス（Apo）とネクローシス（Nec）に大別される。放射線治療後の腫瘍内では，放射線が腫瘍細胞へ直接アタックした結果，引き起こされるApoやNecばかりでなく，腫瘍組織を構成する腫瘍血管の傷害により引き起こされる酸素や栄養枯渇を介した間接的な腫瘍細胞のApoやNecも含まれる。これら腫瘍内で誘発されるApoやNecを非侵襲的リアルタイムに可視化するシステムは，その光情報を指標とし，放射線による腫瘍内細胞死の時間的空間的動態解析を可能にすると考えられる。我々は，リアルタイム細胞死可視化システムの構築を目的に，Apo可視化システムとNec可視化システムの構築を行っている。Apo可視化システムに関しては，昨年度までにエビ由来Lucを用いることで，Apo誘発時の発光を従来構築したホタル由来Lucシステムと比較し高発光型へ改良し，また37℃3時間処理後においても発光の低下を認めない熱安定性に優れたシステムの構築に成功している。低酸素細胞Apo可視化システムも同様にエビ由来Lucを用い改良した。Nec可視化システムに関してもエビ由来Lucを用い，2断片Luc可視化プローブにタンパク質安定に関与するIgG-Fc配列を付加することで，熱安定性に優れた高発光型Nec可視化システムへの改良に成功している。今年度，我々はこれまでに構築したそれぞれの可視化システムを発現する細胞株をヌードマウスに移植し，生体腫瘍内で誘発されるApoおよびNecのリアルタイム可視化をおこなった。その結果，抗がん剤スタウロスポリン（STS）投与により腫瘍内で誘発されるApoおよび低酸素細胞Apoの可視化に成功した。また，腫瘍成長に伴い腫瘍内に形成されるNec，および物理的破壊（針刺し）または化学的破壊（界面活性剤注入）により腫瘍で誘発されるNecのリアルタイム可視化にも成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
腫瘍内Apoの可視化には，腫瘍内部の酸素濃度に関係なくApoを可視化するシステム（Apo可視化システム），及び低酸素細胞のみのApoを可視化するシステム（低酸素細胞Apo可視化システム）を，ホタル由来Lucおよびエビ由来Lucを用い構築した。これらApo可視化システムを発現する安定細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍を形成後，腹腔内へ抗がん剤STSを投与し，高感度CCDカメラを用い腫瘍内Apoのリアルタイム可視化を試みた。エビ由来Apo可視化システムを発現する腫瘍から発光は認められなかったが，ホタル由来システムを発現する腫瘍からは発光が認められ，Apoのリアルタイム可視化に成功した。これは，in vitroで高い発光を示したエビ由来システムの結果と一致しない。エビ由来Lucの基質フリマジンは，ホタル由来Lucの基質D-ルシフェリンと比較しマウス体内では非常に不安定であることが知られており，急速に分解され，低い発光に至ったと考えられる。低酸素細胞Apo可視化システムを発現する腫瘍においても，同様にホタルLuc由来システムにおいてSTS投与後に発光値の上昇を認め，腫瘍内低酸素細胞Apoのリアルタイムイメージングに世界で初めて成功した。Necの可視化に関しては，高発光型Nec可視化システムを発現する安定発現細胞株を構築し，腫瘍形成に伴い腫瘍内で形成されるNecのリアルタイムイメージングを試みた。発光基質であるフリマジンを腫瘍に直接注入した場合に強く発光し，腫瘍成長に伴い血管新生が追いつかず腫瘍内に形成されるネクローシスの可視化に成功した。さらに物理的，化学的破壊により腫瘍内で誘発されるネクローシスの可視化を試みた。物理的破壊である針刺しをおこなった腫瘍，または化学的破壊である組織溶解試薬を注入した腫瘍において，発光値は未処理の腫瘍と比較し有意に上昇しイメージングに成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究目的達成のため，以下の2つ項目を研究期間内に実施予定である。
１．X線照射により誘導される腫瘍内Apo及び低酸素細胞Apoのリアルタイムイメージング： Apo可視化システムを発現する安定発現細胞株をマウス皮下に移植し，担がんマウスを作製する。腫瘍にX線照射または化学療法で用いられる抗がん剤を投与し，Apoを誘導後，高感度CCDカメラを用いApoの可視化を試みる。低酸素細胞Apo可視化細胞株についても同様な実験をおこない，X線および抗がん剤の腫瘍内低酸素細胞への殺細胞効果を発光値を指標に解析をおこなう。さらに低酸素領域のみで細胞毒性を示す低酸素活性化プロドラッグTH302を用い，腫瘍における低酸素細胞Apo可視化システムの機能を免疫組織染色と共に確認する。
２．赤色に発光するホタル由来AkaLucを用いたネクローシス可視化システムの再構築：構築したネクローシス可視化システムは，エビ由来Lucを基本骨格としている。このため，in vitro実験では高い発光値を示すが，マウス腫瘍を用いたin vivo実験では発光基質フリマジンが体内で急速に分解されるため，腫瘍に直接投与しない限り発光は得られない。このため，体内でフリマジンより安定なD-ルシフェリンを基質にもつホタル由来Lucを用い，ネクローシス可視化システムの再構築をおこなう。また，発光波長613 nm（赤色）を有する改良型のホタル由来AkaLucを用いることで，腫瘍深部からの発光も検出できるように，さらにApo可視化システムからの発光波長と区別できるようにシステムをデザインする。AkaLucを用いた新規ネクローシス可視化システムとこれまでに構築したApo可視化システムを用い，同一腫瘍同時イメージングによる細胞死（ApoとNec）の腫瘍内分布や経時変化等の4次元動態解析を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額（B-A）は、ほぼゼロと等しく、計画通りに研究は進んでいる。申請書に示した研究スケジュールどおりに、次年度は、腫瘍内細胞死の動態解析および放射線治療、化学放射線療法における照射条件の検討を行う予定である。
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