次世代シーケンサーを用いた若年性骨髄単球性白血病のメチル化解析法の開発

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07816
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 村松 秀城 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (00572570)
• 研究分担者: 奥野 友介 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院講師 (00725533)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 小児血液学

研究実績の概要

若年性骨髄単球性白血病（JMML）は予後不良な小児骨髄増殖性疾患である。我々はイルミナ社450kメチル化アレイを用いたメチル化プロファイリングを行い、高メチル化群の予後が不良であることを明らかにした（Murakami N, et al. Blood 2018）。
イルミナ社の450kメチル化アレイは豊富な実績がある安定したDNAメチル化解析プラットフォームである。しかしながら、その解析コストは安価ではなく、実臨床の現場に実装する上では、より低コストかつハイスループットな検査法の開発が求められる。本研究では、450kメチル化アレイ解析を実施済みの臨床検体を用いて、Digital restriction enzyme analysis of methylation （DREAM）法によるメチル化解析を実施した。DREAM法は、同じCCCGGG配列を認識するが、シトシンがメチル化していると切断しない制限酵素（SmaI）およびメチル化していても切断する制限酵素（XmaI）で順番にDNAを処理し、その後イルミナ社の次世代シーケンサーでショートリードシーケンスを行う方法である。
同法を用いて、101例のJMML患者のメチル化解析を行った。教師なしクラスタリングを施行したところ、2つのサブグループ（高メチル化群・低メチル化群）に分類することが可能であった。450kによる分類と、今回のDREAM法による分類の一致率は、95.0％であった。
ドイツ、サンフランシスコと協力して、約300例のJMML患者検体の450kメチル化アレイデータの共同解析を行い、解析方法のハーモナイゼーションを完了し、国際共同研究として論文投稿準備中である。また、患者年齢、HbF、RAS経路遺伝子変異など、シンプルな臨床情報によるメチル化分類の予測統計モデルを作成に成功した。あわせて論文投稿準備中である。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初の計画どおり、DREAM法による全ゲノムメチル化解析の解析パイプラインを構築し、450kアレイによるJMMLのメチル化分類の結果を高度に再現できることを明らかにすることができた。費用は450kの約1/6と安価であり、特定の製品に依存しない優れた解析方法である。同法を用いてJMML患者を層別化することで、JMML患者の治療方針決定に対して有用な情報を得ることが可能であることを示すことができた。validationコホートとして、日本人JMMLに加えて、サンフランシスコのグループとの共同研究として、アメリカ人JMML患者においても同様に予後予測できることを確認することができた。現在、論文作成作業もほぼ完了しており、間もなく投稿できる見込みである。また、後述する国際共同研究によるメチル化アレイの解析パイプラインのハーモナイゼーションについても計画以上のペースで進行しており、こちらも論文作成作業がほぼ完了し、間もなく投稿できる見込みである。

今後の研究の推進方策

2017年9月にローマで行われたEWOG-MDSシンポジウムで、申請者らを含む各国のメチル化アレイの結果に基づくリスク分類のデータが発表され、他国のグループ（ドイツ、サンフランシスコ）もJMML臨床検体を用いた450kメチル化アレイによる解析を進めていることが明らかとなった。アレイデータのデータ処理・クラスタリングの手法は単一ではなく、臨床研究グループごとにリスク分類の定義づけが異なると、お互いの臨床研究の成果を比較検討することが今後、大変困難となることが予想された。申請者は、メチル化解析に基づくリスク分類を実臨床で利用するにあたり、リスク分類のハーモナイゼーションが必要であることを提案し、ハイデルベルク大学のDaniel Lipka博士、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のElliot Stieglitz博士と同意が得られた。それぞれのデータの論文発表
がなされ、3グループ合計で約300例のアレイデータを共有し、共同解析を行い、解析方法のハーモナイゼーションについてほぼ完了した。現在、国際共同研究として複数の論文投稿準備中である。さらに、臨床情報を用いた遺伝子メチル化状態の統計学的予測モデルを作成し、有効性を確認することができた。現在、論文作成中である。

研究成果

• [雑誌論文] Essential role of PTPN11 mutation in enhanced haematopoietic differentiation potential of induced pluripotent stem cells of juvenile myelomonocytic leukaemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shigemura T, Matsuda K, Kurata T, Sakashita K, Okuno Y, Muramatsu H, Yue F, Ebihara Y, Tsuji K, Sasaki K, Nakahata T, Nakazawa Y, Koike K
  • 雑誌名: Br J Haematol 巻: 187 ページ: 163-173
  • DOI: 10.1111/bjh.16060
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Successful hematopoietic stem cell transplantation from an HLA-mismatched parent for engraftment failure after unrelated cord blood transplantation in patients with juvenile myelomonocytic leukemia: Report of two cases. (2019)
  • 著者名/発表者名: Akahane K, Watanabe A, Furuichi Y, Somazu S, Oshiro H, Goi K, Sakashita K, Muramatsu H, Hama A, Takahashi Y, Koike K, Kojima S, Sugita K, Inukai T
  • 雑誌名: Pediatr Transplant 巻: 23 ページ: e13378
  • DOI: 10.1111/petr.13378
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Detection of Subclonal SETBP1 and JAK3 Mutations in Patients with Juvenile Myelomonocytic Leukemia Using Droplet Digital PCR (2019)
  • 著者名/発表者名: Manabu Wakamatsu, Norihiro Murakami, Yusuke Okuno, Nobuhiro Kitazawa, Hideki Muramatsu, Seiji Kojima, Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: The 10th JSH International Symposium 2019
  • 国際学会
• [学会発表] Integrated molecular profiling of juvenile myelomonocytic leukemia (2019)
  • 著者名/発表者名: Hideki Muramatsu
  • 学会等名: The 29th Symposium of the International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases (IACRLRD 2019)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] droplet digital PCRを用いた若年性骨髄単球性白血病におけるサブクローナルなSETBP1とJAK3変異の検出 (2019)
  • 著者名/発表者名: 若松学、村上典寛、奥野友介、北澤宏展、山森彩子、今屋雅之、吉田太郎、三輪田俊介、成田幸太郎、北澤展典、濱田太立、市川大輔、谷口理恵子、西川英里、川島希、成田敦、 西尾信博、村松秀城、小島勢二、髙橋義行
  • 学会等名: 第277回日本小児科学会東海地方会
• [学会発表] Detection of subclonal SETBP1 and JAK3 mutations in patients with juvenile myelomonocytic leukemia using droplet digital PCR (2019)
  • 著者名/発表者名: Manabu Wakamatsu, Norihiro Murakami, Yusuke Okuno, Nobuhiro Kitazawa, Hideki Muramatsu, Seiji Kojima, Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: 61th American Society of Hematology Annual Meeting & Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Comprehensive Mutational Analysis of Juvenile Myelomonocytic Leukemia using Whole-genome Sequencing (2019)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Okuno, Hideki Muramatsu, Norihiro Murakami, Nozomu Kawashima, Manabu Wakamatsu, Hironobu Kitazawa, Tomoo Ogi, Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: 61th American Society of Hematology Annual Meeting & Exposition
  • 国際学会
• [学会発表] Genome-wide Methylation Analysis using the Digital Restriction Enzyme Analysis of Methylation for Stratification of Patients with Juvenile Myelomonocytic Leukemia (2019)
  • 著者名/発表者名: Hironobu Kitazawa, Hideki Muramatsu, Norihiro Murakami, Yusuke Okuno, Manabu Wakamatsu, Taro Yoshida, Masayuki Imaya, Ayako Yamamori, Shunsuke Miwata, Kotaro Narita, Motoharu Hamada, Daisuke Ichikawa, Rieko Taniguchi, Nozomu Kawashima, Eri Nishikawa, Atsushi Narita, Nobuhiro Nishio, Seiji Kojima, Yoshiyuki Takahashi
  • 学会等名: 61th American Society of Hematology Annual Meeting & Exposition
  • 国際学会