| 研究課題/領域番号 |
18K07834
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
原 好勇 久留米大学, 医学部, 准教授 (40309753)
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| 研究分担者 |
柏木 孝仁 久留米大学, 医学部, 准教授 (70320158)
渡邊 浩 久留米大学, 医学部, 教授 (90295080)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | RSV / 抗ウイルス薬 / Pタンパク質 / Lポリメラーゼ / ペプチド薬剤 |
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| 研究実績の概要 |
RSウイルスは乳幼児、高齢者、免疫低下者に重い下気道感染症を引き起こす場合がある。ところが迅速診断キットはあるものの、未だ有効なワクチンや治療薬が存在しない。そこで本研究では、新規抗RSウイルス薬を開発することを目的とした。これまでの研究で、ウイルス自身のPタンパク質由来ペプチド「P 断片」に非常に強い抗ウイルス作用があることを見出した。また、Pタンパク質は通常ウイルス複製酵素Lをウイルス遺伝子まで運ぶ働きをしているが、機能解析の結果、P断片は正常型Pを標的とし複製酵素Lを強力に阻害していることを明らかにした。
これまではプラスミドを培養細胞へトランスフェクションする実験で、かつウイルスのミニゲノム実験系を用いたものであった。そこでP断片に見出した抗ウイルス活性が、実際にウイルス感染を阻止するか調べるため、初年度はP断片の大量精製法を確立することにした。精製を容易にするためP断片のC末端側にタンデムアフィニティータグ（TAPタグ）を付加し、これを発現する組換えバキュロウイルスを作製した。SF21昆虫細胞へ感染させ、細胞内で発現したP断片をIgGセファロースへ吸着させた。そしてTEVプロテアーゼでタグを切断しP断片を遊離させた。回収したサンプルをニッケルアガロースと混合し、サンプル中に含まれるTEVプロテアーゼ（Hisタグ付）を除去し最終精製品を得た。P断片をSDS-PAGE（CBB染色）で解析した場合の純度は95％以上で、収量は細胞培養1Lあたり約1 mgの「mgオーダー」の大量精製に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
立案した計画に沿って、組み換えバキュロウイルスを作製し「P 断片」の大量精製法を確立することができた。また国際および国内学会で成果を報告することが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
大量精製した「P 断片」を用い、培養細胞系でのRSウイルス感染実験を行い阻害薬としての有効性を検証する。培養細胞にはRSウイルスでよく利用されるHEp-2細胞（ヒト咽頭癌由来）を用いる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：当初、ゲル濾過用カラムを購入する予定だったが、それを使用しない精製法を確立でき不要になったため購入しなかった。またタンパク質精製試薬の購入費が少なくて済んだため。
使用計画：ウイルス感染実験に向けて新鮮なタンパク質を実験ごとに大量精製する必要がある。そのための培養細胞の維持、タンパク質の精製に必要な試薬購入に充てる計画である。また論文投稿に必要な経費に使用する計画である。
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