| 研究課題/領域番号 |
18K07839
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
鹿島田 健一 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (80451938)
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| 研究分担者 |
森尾 友宏 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30239628)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 卵巣発生 / 転写制御 / エンハンサー / トランスクリプトーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、幹細胞（ES細胞）からの安定した性腺体細胞の作製法の開発、性腺機能不全患者における臨床応用を行なうことを最終目標とし、性腺体細胞の分化および維持における転写分子制御機構の網羅的解明を目的とする。
性腺体細胞WT1陽性細胞のみにEGFPおよびmCherryを発現する、WT1-RG マウスを用い、FACSを利用し、胎生期マウス 胎生13.5日、16.5日、生後0日の３ポイントで性腺体細胞の検体をXX, XYマウスより集め、網羅的トランスクリプトーム解析法であるCAGE法でenahncerを同定することが技術的に可能であることを確認し、この手法を用い、胎生13.5日、16.5日、生後0日の３ポイントでの検体(n=3)の総RNAを回収し、CAGE法で解析を行った。得られたデータに対し、統計学的手法を用い、target遺伝子の発現量変化とenhancer RNAと思われる領域のRNA発現量の相関を解析した。この結果、卵巣特異的分子の上流から下流にかけて３領域のenhancer候補領域を特定した。in vitroのreporter解析では、enhacer活性があることが示された。特にRSPO1のenhancer候補領域の活性が高かった。以上のenhancer候補領域について、以下３つの解析を行った。
ヒトの46,XX DSDで遺伝学的な診断がついていない患者、および早発閉経など卵巣機能が障害されている患者、DNA検体約100例を用い、該当する領域について、欠失の有無をカスタムアレイ法で、また配列の多型についても併せてsequenceを行い、解析をしている。
また候補領域を欠失したノックアウトマウス、および候補領域にLacZをレポーターとして連結した配列をもつトランスジェニックマウスを作成し解析を併せて行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
すでに実績として、経時的な組織のtranscriptome解析によるenhancer RNA活性をみることで、enhancerの同定が可能である可能性について示すことができた。また2019年度の予定として昨年示した、候補領域のin vitroは終了し、ヒトの解析はほぼ終了している。さらに遺伝子改変マウス作成については、ノックアウトマウスがF1まで作成ができている。以上を踏まえ概ね予定通りであり、順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
作成したノックアウトマウスの解析を行うとともに、トランスジェニックマウスの作成を引き続き行う。マウスから得られたデータと、ヒトの解析結果を併せ、エンハンサー候補領域の機能の策定を行う。さらに本手法を用い、精巣においても同様の形でのenhancer候補領域の同定について行うことを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品が年度内の請求に間に合わなかったため、次年度に他の消耗品と併せて購入する予定である
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