2019 年度実施状況報告書

タイチン分解酵素を阻害するDuchenne型筋ジストロフィーの新しい治療標的

研究課題

研究課題/領域番号	18K07845
研究機関	神戸大学
研究代表者	粟野宏之神戸大学, 医学研究科, 准教授 (30437470)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	筋ジストロフィー / カルパイン
研究実績の概要	神戸大学医学部附属病院に通院し、DMD遺伝子検査にて確定診断されたDuchenne型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者、Becker型筋ジストロフィー(BMD)と診断された患者の骨格筋からｍＲＮＡを抽出した。mRNAを逆転写反応にてcDNAに変換し、カルパイン関連遺伝子発現について検討を行った。コントロールとして購入した健常人の筋ｍＲＮＡを用いた。遺伝子発現の内部標準にはＧＡＰＤＨを用いた。発現の検討はサイバーグリーンを用いたリアルタイムＰＣＲシステムで行った。配列の相同性が高いカルパイン１，２のＲＴ－ＰＣＲに用いるプライマーは2018年の検討で決定したものを用いた。ＤＭＤ4人、ＢＭＤ3人の解析をおこなった。健常人での発現を1とした場合、カルパイン1はＤＭＤ患者で約1-2.5倍の変化、ＢＭＤ患者で0.4-2.0倍の変化を認めた。カルパイン2はＤＭＤ患者で約1.5-3.0倍、ＢＭＤ患者で0.3-2.5倍の変化を認めた。これらの結果から、ＤＭＤ患者では筋蛋白消化酵素であるカルパインが健常人にくらべ発現が増加していることがわかった。次にカルパインを阻害するカルパスタチンの測定では、ＤＭＤ、ＢＭＤともに健常人に比べ発現が低下していた。カルパイン１/カルパスタチン比を計算すると、ＤＭＤ患者の25％とＢＭＤの33％比が1.0より低く、カルパイン１発現に対し、カルパスタチン発現が亢進している傾向がみられた。カルパイン2/カルパスタチン比の検討でも同様の傾向がみられ、筋ジストロフィー患者の骨格筋におけるカルパイン１，２の発現亢進に対して、抑制系の機能が作用していることが明らかになった
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由研究に使用する骨格筋検体で保存状態が良好でないものがおおく、ＲＴ-ＰＣＲに使用するためのｍＲＮＡの抽出が困難である場合がある。
今後の研究の推進方策	検体数を増やし同様の検討を行う。年齢、運動能力、生化学データ、生理検査、骨格筋画像検査などの臨床データと比較し、ＤＭＤ/ＢＭＤにおけるカルパイン発現の病態的意義について検討する。
次年度使用額が生じた理由	2019年度ではＲＴ－ＰＣＲを用いた実験を終了させ、その結果をもって蛋白解析の実験に取り組む予定であったが、検体の入手やサンプルの調整などの問題でＲＴ－ＰＣＲの実験を終了させることができなかった。このため、この後の実験に使用する予定であった助成金を2020年度に繰り越すこととした。