| 研究課題/領域番号 |
18K07855
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
出口 貴美子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師(非常勤) (50227542)
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| 研究分担者 |
久保 健一郎 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (20348791)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 虚血 / 脳障害 / エレクトロポレーション / 神経細胞移動 / シナプス |
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| 研究実績の概要 |
虚血性脳障害モデルを作成する過程で、妊娠後期（E16.5前後）マウスの胎児脳室内にGFP 発現ベクターを注入し、これを子宮内エレクトロポレーションで脳室壁の神経幹細胞に遺伝子導入した後、一定時間による子宮動脈結紮により胎児脳に虚血負荷を掛けた。虚血を解除した後、胎児を子宮内に戻し、生後４週まで経時的に脳組織を採取し、凍結切片を作製して、特に前頭前皮質に注目して、組織学的な解析を行った。この手法を用いることによって、神経細胞の樹状突起や軸索がGFPで可視化され、シナプスを含めた微細な構造異常について共焦点レーザー顕微鏡を用いて、詳細に捉えた。皮質II層の神経細胞を標的としてスパインの数、形態を定量的に解析した。今後、さらに例数を増やして、シナプス病態の有無について検証する。
虚血負荷を受けた神経細胞が後にスパインの形態的あるいは機能的異常を来す分子機序を明らかにするために、上記の虚血モデルマウスの脳からRNAを抽出したのち、マイクロアレイ解析を行い、虚血ストレスに伴う細胞自律的な変化を描出した。これまでに行った遺伝子発現解析から炎症性因子の上昇などが見られていることから、ミクログリアやアストロサイトの変化に注目した形態学的解析を行った。
また、上記の虚血性脳障害モデルにおいて神経細胞のラベルを行う際に、これまでに確立したマウス子宮内電気穿孔法を用いた部位特異的神経細胞ラベル法に加えて、最近開発されたフラッシュ・タグ法を改変した新たな手法を用いて、脳内の異なる領域の細胞移動を同時に可視化するための条件検討を行った。その結果、虚血性脳障害モデルマウスにおいて、これまでに注目していなかった領域においても神経細胞移動の変化を見出した。今後、さらに例数を増やして、定量的な解析を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
最近開発されたフラッシュ・タグ法を改変した新たな手法を用いて、脳内の異なる領域の細胞移動を同時に可視化するための条件検討を行ったところ、独自に開発した虚血性脳障害モデルマウスにおいて、これまでに注目していなかった領域においても神経細胞移動の変化を見出した。当初予期していなかった、予想外の方向への研究の進展ではあるが、この所見に基づきながら、今後当初の目的である回路やスパインの異常を生じる分子的変化を明らかにしていくことができるため、初年度としては順調な進展であると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに確立したマウス子宮内電気穿孔法を用いた部位特異的神経細胞ラベル法に加えて、最近開発されたフラッシュ・タグ法を改変した新たな手法を用いて、神経細胞を蛍光タンパク質でラベルする。蛍光タンパク質でラベルされた細胞を、FACSで回収するか、脳の組織切片から標的部位の細胞を切り出しするレーザー・マイクロダイセクション（LMD）法を用いて、トランスクリプトーム解析を実施し、様々な細胞集団における遺伝子発現プロファイルの変化をグローバルに捉え、細胞間の病態関連性におけるキーとなる遺伝子／分子的変化を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品や実験材料の効率的な使用が可能であったため。引き続き、消耗品や実験材料の効率的な使用を行いながら、次年度の研究計画目標を達成する。
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