| 研究課題/領域番号 |
18K07858
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| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
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研究代表者 |
古谷 喜幸 東京女子医科大学, 医学部, 研究生 (10424673)
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| 研究分担者 |
羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 非常勤講師 (00349698)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | SCN5A / LQT3 / 疾患iPS細胞 / 心筋細胞 |
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| 研究実績の概要 |
初年度は、研究1 「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」を進めるため、Nav1.5野生型及び変異を恒常的に発現する哺乳類細胞の作製を実施した。野生型のSCN5A遺伝子のコード領域にc.4868G>A (R1623Q)変異導入した発現ベクター（PSF-CMV-UB-HYGRO-SV40-FLAG-SCN5A, WT又はR1623Q変異）を作製した。またヒト胎児トータルRNA（市販品）から胎仔・新生児型のSCN5A エクソン6aを含む塩基配列をクローニングし、野生型のSCN5Aにはめ込んだ新生児型エクソンを持つSCN5Aコード領域を作製し、野生型と同様にR1623Q変異を導入した。これらの4種類のSCN5Aを挿入した哺乳類発現プラスミドについて、そのSCN5A塩基配列をシークエンスにより確認した。これらの発現プラスミドをそれぞれ293T細胞に導入し、ハイグロマイシン選択により、現在、Nav1.5を恒常的に発現する複数のクローン株を作製している。野生型Nav1.5発現細胞株用い、オートパッチクランプ法により典型的なNa電流を測定することができた。
研究２の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」に関しては、当該研究室に凍結保存されていた不死化B細胞株を用いて、R1623Q変異をもつLQT3患者1名並びに複数の健常者のiPS細胞を調製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究1 「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」に必要な野生型、新生児型のSCN5A遺伝子並びにターゲット変異(c.4868G>A)導入した哺乳類発現ベクター4種類を作製できた。これらの発現プラスミドを293T細胞に導入し、抗生剤選択により、Nav1.5恒常発現クローン株を作製し、その手法を確立した。オートパッチクランプ法によりNa電流の測定を始めることができた。また、研究２の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」を実施するために、R1623Q変異をもつLQT3患者1名並びに複数の健常者のiPS細胞を調製できた。初年度は、本研究に必要な細胞（野生型と変異型をそれぞれ発現するNav1.5恒常発現293T細胞株とR1623Q変異をもつLQT3患者1名と複数の健常者のiPS細胞）をほぼ調製することができた。よって、概ね順調な進捗状況と考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、研究1の「Nav1.5発現細胞を用い変異によるNa電流の変化を検討」を完成させるため、Nav1.5発現細胞株の複数を用いて、オートパッチクランプ法によるNa電流の測定を進める。これにより、野生型と新生児型のSCN5A遺伝子におけるR1623Q変異の特徴を電気生理学的に明らかにする。
研究２の「疾患iPS細胞分化心筋細胞を用いた機能解析」のために、健常者とR1623Q変異をもつLQT3患者のiPS細胞から心筋細胞への分化を実施する。iPS細胞由来の分化心筋細胞を用いて、マルチ電極アレーシステム（MED64）を用いた電気生理学的特性の評価を行う。心電図のQT 間隔に該当する細胞外電位や拍動頻度を計測し、チャネルの変異によるQT 間隔延長などの評価を行う。薬理学的研究にもMED64 システムを用い、分化心筋細胞に様々なβ遮断薬・Na 遮断薬を種々の濃度で添加し細胞外電位等を測定し、その効果から患者に有効な治療薬の選択のための資料とする。
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