| 研究課題/領域番号 |
18K07866
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所) |
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研究代表者 |
山崎 美和 (若林美和) 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 環境影響部門, 流動研究員 (50455549)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Pit1 / Pit2 |
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| 研究実績の概要 |
骨基質の石灰化は、骨芽細胞から出芽的に分泌される基質小胞を介して開始され、骨芽細胞および基質小胞の膜上にはⅢ型ナトリウム/リン酸 (Na/Pi) 共輸送担体であるPit-1やPit-2が存在する。本研究においては、骨石灰化におけるⅢ型Na/Pi共輸送担体の役割について解析を試みた。Pi存在下で分化能を有するマウス骨芽細胞系細胞株MC3T3-E1 Subclone4にCRISPR/Casを適用することにより、Pit1ノックアウト(Pit1-KO)細胞とPit2ノックアウト(Pit2-KO)細胞を樹立した。Pit1-KO、Pit2-KO共にPi取り込み能は減弱していたが、3 mM Pi存在下で8週間培養した際の石灰化はむしろ亢進していた。3 mM Pi存在下で2週間培養した際のアルカリフォスファターゼ染色は全ての細胞において差は見られなかった。1, 4, 7 mM Pi存在下で24時間培養し、短期的なPi刺激に対する応答性を検討したところ、Pi刺激で惹起されるOsteopontinやDmp1の発現誘導はPit1-KO、Pit2-KOにおいてもコントロール細胞と同様に認められた。次に、Pit1やPit2の欠損がピロリン酸(PPi)代謝に及ぼす影響を検討するため、細胞内外のPPiを測定した。1 mM Pi存在下の細胞内PPiはPit1-KO、Pit2-KOではコントロール細胞と比して減少しており、全ての細胞で24時間の7 mM Pi刺激により細胞内PPiが低下した。一方、細胞外PPiは1 mM Pi存在下のPit1-KO、Pit2-KOで上昇しており、7 mMPi刺激では影響が見られなかった。PPiを細胞外へ輸送する膜蛋白質であるAnkの発現は7 mM Pi刺激で全ての細胞で有意に上昇した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Ⅲ型ナトリウム/リン酸共輸送担体をノックアウトした骨芽細胞株を作成し、ピロリン酸アッセイ系が確立でき、石灰化やピロリン酸代謝等に興味深い結果が得られているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス骨芽細胞系細胞株MC3T3-E1 Subclone4にCRISPR/Casを適用しPit1ノックアウト(Pit1-KO)細胞とPit2ノックアウト(Pit2-KO)細胞を樹立した。Pit1-KO、Pit2-KO共にPi取り込み能は減弱していたが、3 mM Pi存在下で8週間培養した際の石灰化はむしろ亢進していた。ヒトにおけるPit2の機能喪失型変異は両側基底核に病的な石灰化を認める特発性基底核石灰化症を呈する。今後は骨における正常な石灰化と、他の組織での病的な石灰化におけるⅢ型Na/Pi共輸送担体の役割を明確にするよう解析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は国際学会に参加しなかったため旅費の節約が可能となった。次年度は電子顕微鏡の撮影やプロテオーム解析の外注を予定しているためまとまった予算が必要となり、次年度分の請求助成金と合わせて使用する予定である。
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