| 研究課題/領域番号 |
18K07930
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
岡田 浩介 筑波大学, 附属病院, 病院講師 (80757526)
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| 研究分担者 |
石毛 和紀 筑波大学, 医学医療系, 客員研究員 (20597918)
蕨 栄治 筑波大学, 医学医療系, 講師 (70396612)
正田 純一 筑波大学, 医学医療系, 教授 (90241827)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | NASH / NASH肝癌 / p62 / 組織細胞特異的レスキューマウス |
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| 研究実績の概要 |
NASH肝発癌におけるNrf2およびp62の役割を明らかにすることを目的として，本年度は以下の研究を実施した．
組織細胞特異的p62およびNrf2遺伝子レスキューマウスの作製：p62およびNrf2遺伝子のイントロンに、LoxP配列で挟まれた転写終結シグナルおよびpolyA付加シグナル配列を挿入したノックインマウス（p62 KI/KI, Nrf2KI/KI）を作製し，このマウスとの交配により，Nrf2KI/KIかつp62-/-マウスとp62KI/KIかつNrf2-/-マウスを得た．このマウスは，全身でp62およびNrf2遺伝子が二重欠損しており，NASHを発症する．次に，全身でのp62とNrf2遺伝子二重欠損下において，組織特異的にp62とNrf2の発現をレスキューするために，Vill-Cre（腸管上皮），Albumin-Cre（肝細胞），Adipoq-Cre（脂肪細胞），Lyz2-Cre（Kupffer細胞）マウスとの交配を開始した．Nrf2ノックインマウスのgenotypingに不具合が見つかり繁殖に遅れが出たため，p62KIKIかつNrf2-/-系統（p62レスキュー）の作製繁殖を優先して行い，p62KIKIかつNrf2-/-かつAlbumin-cre/+マウス（肝細胞特異的p62レスキューマウス），p62KIKIかつNrf2-/-かつAdipoq-cre/+マウス（脂肪細胞特異的p62レスキューマウス），p62KIKIかつNrf2-/-かつLyz2-cre/+マウス（Kupffer細胞特異的p62レスキューマウス）の作製に成功した．
今後繁殖を継続し，個体数が揃った段階で高脂肪食の摂餌を開始し通常食を含め，DKOマウスとのNASH病態表現型の比較を行う予定である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Nrf2ノックインマウス（KIKI）の繁殖過程で遺伝子型判定（ジェノタイピング）に一部不具合があり，確認と修正のため繁殖に遅れが出ている．
p62ノックインマウスについては目的遺伝子型マウスの獲得に成功したが，三重の遺伝子改変を行っているため通常より繁殖速度が遅く，実験に十分な数を得るため今後も繁殖を継続する．
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| 今後の研究の推進方策 |
比較解析に十分な個体数（各群10匹程度）の組織細胞特異的レスキューマウスを得られた段階で高脂肪食摂餌（対照は通常食）を開始する．経時的に体重測定を行い，19週齢および32週齢で解剖し，全身p62およびNrf2遺伝子二重欠失マウスと，NASH病態と肝癌についての表現型（個数，病理学的悪性度など）を比較し，どの組織（臓器）のp62もしくはNrf2が肝癌の発生に重要であるか，あるいはどのように肝癌発生を防御しているかを明らかにする．
また，p62およびNrf2CRISPR/Cas9 systemを用いてノックアウトした肝細胞（Hepa1-6）およびマクロファージ細胞（RAW264.7）を用いて，今後p62とNrf2のノックアウトによる肝発癌シグナルの変化を，immunoblotで解析する計画である．
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