| 研究課題/領域番号 |
18K07969
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
松浦 稔 杏林大学, 医学部, 准教授 (30402910)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 炎症性腸疾患 / 鉄動態 |
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| 研究実績の概要 |
鉄は生体内での酸化ストレスの生成や腸内細菌の増殖、毒性変化を介して炎症性腸疾患（IBD）の病態に関与することが示唆されている。一方、慢性炎症刺激は鉄代謝制御因子であるHepcidinを介した体内の鉄動態の変化によりマクロファージ内の鉄量を増加させ、炎症応答の亢進につながることが報告されている。しかし、IBDの慢性炎症に伴う鉄動態変化、ならびにそれに伴うマクロファージの機能亢進と病態への関与については不明である。２種類のIBD動物モデル（IL-10 KOマウス、TCR-alpha KOマウス）を用いて、腸管炎症の進展に伴う鉄の体内分布とHepcidinおよび血清鉄の経時的変化を検討した。TCR-alpha KOおよびIL-10 KOマウスともに、腸炎発症前から発症時にかけて肝臓におけるHepcidinの遺伝子発現は経時的に増加した。しかし、TCR-alpha KOマウスと比べIL-10 KOマウスではHepcidinの遺伝子発現は著明に低値であった。次に鉄の体内分布の変化について検討した。TCR-alpha KOマウスでは肝臓、脾臓の組織内鉄量(/microgram/組織wet重量)、および血清鉄については経時的変化を認めなかった。しかし、大腸の組織内鉄量は腸炎発症から発症時にかけて経時的に増加していた。一方、IL-10 KOマウスについては各臓器の組織内鉄量に経時的変化を認めなかった。またマクロファージ細胞内鉄量については、組織レベルでの解析が困難と考えられたため、マクロファージ細胞株J774細胞を用いてin vitroで検討した。しかし、マクロファージ細胞内の鉄量がきわめて微量のため、メタロアッセイキットを用いた定量では限界があり測定困難であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の研究計画ではIBD動物モデルの１つであるIL-10KOマウスを用いて腸管炎症の進展に伴う生体内での鉄動態を検討する予定であった。しかし、当動物実験施設でのIL-10 KOマウスの系統維持が一時困難となったことに加え、データの確実性を担保するため他のIBD動物モデル（TCR-alpha KO）でも同様の検討を行い、時間を要した。これまで異なる２つのIBD動物モデルを用いて検討を行っているが、腸管炎症の進展に伴う生体内の鉄動態変化にも若干違いがあり、再現性を確認しながら慎重に検討を進めている。また慢性炎症に伴う鉄の体内分布の変化について免疫組織染色による解析を試みたが、生体内に存在する鉄がきわめて微量であり、組織学的な検討では体内分布の変化を評価することが困難であった。そのため各臓器におけるマクロファージに絞って細胞内の鉄量測定とその機能亢進について解析する方針としたが、各臓器からのマクロファージの単離に難渋していること、加えて、マクロファージ細胞株を用いたin vitroでの検討でも細胞内鉄量が微量で測定困難であり、解析手法の見直しが必要となり進捗が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度も当初に計画した研究実施計画に基づいて解析を進めていく。
１）各臓器からのマクロファージの単離と細胞内鉄量、マクロファージ機能の解析について
各臓器におけるマクロ―ファージに絞って細胞内鉄量の評価を行う必要であるが、J774細胞株を用いても細胞内鉄量が非常に微量であり、これまでの検討では定量的評価が困難であった。今後、新たに鉄イメージングを用いて細胞内の鉄の局在を検討する予定である。また腸管組織からのマクロファージ単離についてはMACSを用いた採取方法ではMACSビーズに含まれる鉄が結果に影響する可能性があるため、他の方法を用いてマクロファージ単離を試み、解析を進める予定である。またマクロファージ機能の解析についてはin vivoでの検討は困難と考え、マクロファージ細胞株（J774細胞）を用いて検討を行う。これらの細胞に鉄負荷あるいは鉄キレート剤を加えてマクロファージ細胞内の鉄量を調整し、炎症性サイトカイン産生や活性化マーカーの発現を比較検討する。
2）鉄代謝関連分子の発現と組織内局在の検討
IBD動物モデル（IL-10 KOおよびTCR-alpha KOマウス）と野生型マウスの各組織(腸管、肝臓、脾臓)における鉄代謝関連分子(鉄吸収：transferrin受容体、divalent metal transporter 1、鉄放出：FPN、鉄貯蔵：ferritin)の発現をWestern blottingと免疫染色を用いて経時的に比較検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた研究計画と比べ、進捗状況が遅れたことで使用した実験マウスや解析サンプルが少なかったこと、それに伴い試薬、抗体などの消費が想定より少なく次年度使用額が生じた。次年度の本研究遂行に必要とされる研究経費は、1）実験マウスの飼育・管理、2）各種抗体および試薬、に当てられる。
（1） 実験マウスの飼育・管理に要する費用：２つの系統の動物モデル（IL-10 KOおよびTCR-a KOマウス）を今後も継続するため、多めの維持管理が必要となる。
（2）各種抗体および試薬に要する費用：これまでと同様、病理組織学的解析やサイトカイン測定やFACS解析に必要な試薬・抗体、生体内の鉄代謝動態を検討するための試薬・キットなどが必要になる。また今後はJ774細胞株を用いたin vitroでのマクロファージ細胞内鉄量や機能解析が必要となり、細胞培養に関連する試薬や消耗品が新たに必要となる。
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