| 研究課題/領域番号 |
18K07977
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
新沼 猛 札幌医科大学, 医学部, 助教 (60708113)
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| 研究分担者 |
鈴木 拓 札幌医科大学, 医学部, 教授 (20381254)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | long noncoding RNA / 胃癌 / 大腸癌 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、癌進展に伴うエピゲノム変化を指標に大腸癌の進展・転移に関わるlncRNAを同定し、診断・治療法開発につなげることを目指す。その達成のため、以下の各段階の目標を設定する。① 申請者らの研究室で培った解析手法を用いて、大腸癌臨床検体のエピゲノムとトランスクリプトームデータを得る。② 大腸癌の臨床病理学的所見を評価し、病期・悪性度と相関するエピゲノム変化を抽出する。発現プロファイルとの統合解析により、エピゲノム変化と連動して発現変動するlncRNAを候補として抽出する。③ in vitro・in vivoでの機能解析を行い、治療標的としての有用性を検証する。④ 多数の臨床検体を用いた解析を行い、診断マーカーとしての有用性を明らかにする。研究の1段階目として、大腸癌・大腸腺腫・正常大腸の遺伝子発現データならびにエピゲノムデータをパブリックデータベースより取得した。使用したデータセットはThe Cancer Genome Atlas(TCGA) 大腸癌データセット、また、正常大腸組織と大腸腺腫の遺伝子発現データセットとしてGSE8671を取得、大腸癌とその対となる大腸腺腫組織のヒストンH3K4me2のChIP sequenceデータとしてGSE66216を取得。GSE66216はhg38リファレンスゲノムにbowtie2にてマッピング、macs2にてピークコールを行った後に、macs2のbdgdiffにて大腸癌・腺腫間で異なるピークを検出した。このデータにおいて複数の大腸癌にてピークが見られるlncRNAに着目し、TCGA並びに、GSE8671の解析を行い、正常大腸に比べ大腸癌・大腸腺腫において発現が亢進しているlncRNAを抽出した。これらのlncRNAの発現を大腸癌細胞株においてqPCRにて確認し、正常に比べ発現亢進している遺伝子についてさらに機能解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現時点では大腸癌進展に関与する可能性のあるlncRNA候補の同定し、lncRNAの細胞株における発現状況の確認を確認した。現在、機能解析実験に向け遺伝子クローニングまたは合成発注によるによる発現ベクター構築を行っているところである。
癌おいて増殖能・遊走能などに対して機能的なlncRNAであることが確認されたのちには、さらにそのlncRNAの機能についてその局在や相互作用するタンパク質、クロマチンとの相互作用などを詳細に検討する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸癌・大腸腺腫において正常大腸上皮に比して発現が亢進しているlncRNAについて解析を進める。大腸癌細胞株における遺伝子発現状態の確認を行い、lncRNAに対する特異的なsiRNAによるノックダウン、またはlncRNAを発現するベクターの遺伝子導入によりlncRNAの機能を解析する。方法としては細胞増殖能、細胞遊走能・浸潤能を各種アッセイによりin vitro , in vivoにおいて評価する。腫瘍促進的機能が認められるlncRNAについてはRNAプルダウン法によりRNA・タンパク複合体を抽出し、質量分析法で結合タンパクを同定する。またmiRNAに対するcompeting endogenous RNA (ceRNA)としての機能している可能性を考え、lncRNAの発現変化に伴って発現変動するmiRNAを網羅的に探索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度はpublic databaseより遺伝子発現データ並びにエピゲノムデータを取得し候補遺伝子の選択を行っているため、ChIP sequencingやgene expression arrayなどを行う事が無かったため次年度使用額が生じた。今後、臨床検体の取得に伴い、マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析やクロマチン修飾の解析のためにChIPシークエンスを行う必要があると考えている。その他のin vitro, in vivoにおけるlncRNAの機能解析についても今後進める予定であり、細胞実験・動物実験・ノックダウン・過剰発現系の構築のために使用する予定である。
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