脂肪性肝疾患での小胞体ストレス、Mallory-Denk体とオートファジーの意義

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K07988
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 原田 大 産業医科大学, 医学部, 教授 (00241175)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 小胞体ストレス / Mallory-Denk体 / オートファジー / 脂肪性肝疾患 / ウイルソン病 / 銅 / C型肝炎

研究実績の概要

肝由来の培養細胞を用いて遊離脂肪酸負荷、銅負荷ならびにC型肝炎ウイルス(HCV)感染の影響を観察した。
遊離脂肪酸負荷では飽和脂肪酸であるパルミチン酸にて小胞体ストレスが引き起こされた。それに伴いオートファジーの流れに異常が生じた。オートファゴゾームの形成には異常はなく、ライソゾームの酸性化とカテプシン活性にも異常はなかった。異常はオートファゴゾームとライソゾームの癒合の障害であった。これに少量の小胞体ストレス誘導剤を投与するとアポトーシスを生じた。これらの障害はオレイン酸やエイコサペンタエン酸にて回避されたが、その作用には小胞体ストレス誘導剤の種類によって異なっていた。また亜鉛がパルミチン酸による小胞体ストレスを改善した。
ウイルソン病においては脂肪肝を伴うことが知られている。銅負荷においては酸化ストレス、小胞体ストレスが起こり、パルミチン酸と同様にオートファジーの障害を生じた。この障害もオートファゴゾームの形成等に異常はなく、オートファゴゾームとライソゾームの癒合の段階の異常であった。また、銅はMallory-Denk体類似の封入体を形成し、少量のプロテアソーム阻害剤を追加するとそれは増加した。これも亜鉛により改善した。
脂肪化を来す疾患としてC型肝炎ウイルス(HCV)が知られている。現在C型肝炎治療は大変進歩したが、ウイルス排除後も発癌がある。JFH-1感染細胞を用いてオートファジー、酸化ストレス、小胞体ストレス、DNA障害、細胞死、細胞増殖の状態を検討した。HCV感染によりオートファジーの障害、酸化ストレス、小胞体ストレスならびにDNA損傷が起こるが、感染自体では細胞死は起こらず、細胞増殖にも影響がなかった。このことが発癌に関係している可能性があった。またこれらの現象は小胞体ストレス軽減で改善された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究の最大の目標はDNA損傷を伴なう発癌への影響の検討とその対策である。脂肪負荷、銅負荷、HCV感染のモデルを使用しているが、明瞭にDNA損傷が現れるモデルは今の所HCV感染のみである。今後は非アルコール性脂肪肝炎やウイルソン病のことを考えて脂肪負荷、銅負荷に生活習慣のことを考え、少量の酸化ストレスや小胞体ストレスの刺激を加えたモデルの適切な量を現在検討中である。HCV感染に関しては現在ウイルス排除後の発癌が未だ問題であり、感染細胞にインターフェロンや直接型抗ウイルス剤を投与してウイルスを排除したのちの状態を詳細に検討したい。また癌の進展に重要と考えられているオートファジーならびに抗酸化反応であるKeap1-Nrf2の経路と上記ストレスの関連も現在検討中である。
マウスモデルは現在作成して検討中であるが、酸化ストレス、小胞体ストレスやオートファジーの評価がマウスモデルでは困難で様々な抗体等で現在検討中である。

今後の研究の推進方策

脂肪負荷、銅負荷のモデルに関してはツニカマイシン、ピュロマイシン、タプシガルジン、エポキソミシンの追加負荷の適量を見出してDNA損傷が起きるが細胞死に至らないような負荷を見出して様々な酸化ストレスや小胞体ストレスの軽減ならびにオートファジーの亢進の作用を検討する。また封入体形成抑制をhistone deacetylase 6阻害剤にて行い、その影響を検討する。これにより近年注目されている蛋白であるp62が細胞内にdiffuseに存在する場合と封入体に隔離された状態の酸化ストレスや細胞死、細胞増殖への影響の差を考える。HCVモデルに関してはインターフェロンや直接型抗ウイルス剤によりウイルス排除でオートファジー、DNA損傷や細胞増殖にいかなる変化が起こるかを検討する。この時インターフェロンによるウイルス排除と直接型抗ウイルス剤によるウイルス排除に差があるか否かも検討を行う。
マウスモデルにおいては酸化ストレス、小胞体ストレスの検討で綺麗なデータが得られておらず、様々な抗体を変更しながら検討中である。

次年度使用額が生じた理由

2018年は以前に購入した培養試薬、培養器具、抗体や様々な試薬を使用して研究をしていました。なるべく節約して研究をしています。2019年は既に多くの試薬がなくなっていますので、科研費を使用させて頂きます。内容は培養試薬、培養器具、抗体、遺伝子導入試薬や様々なオートファジー、酸化ストレスならびに小胞体ストレスに影響する試薬が主なものです。

研究成果

• [雑誌論文] Predictors of hepatocellular carcinoma recurrence associated with the use of direct-acting antiviral agent therapy for hepatitis C virus after curative treatment: A prospective multicenter cohort study. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakano M, Koga H, Ide T, Kuromatsu R, Hashimoto S, Yatsuhashi H, Seike M, Higuchi N, Nakamuta M, Shakado S, Sakisaka S, Miuma S, Nakao K, Yoshimaru Y, Sasaki Y, Oeda S, Eguchi Y, Honma Y, Harada M, Nagata K, Mawatari S, Ido A, Maeshiro T, Matsumoto S, Takami Y, Sohda T, Torimura T
  • 雑誌名: Cancer Med. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: doi: 10.1002/cam4.2061.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct-acting antiviral agents do not increase the incidence of hepatocellular carcinoma development: a prospective, multicenter study (2019)
  • 著者名/発表者名: Ide T, Koga H, Nakano M, Hashimoto S, Yatsuhashi H, Higuchi N, Nakamuta M, Oeda S, Eguchi Y, Shakado S, Sakisaka S, Yoshimaru Y, Sasaki Y, Honma Y, Harada M, Seike M, Maeshiro T, Miuma S, Nakao K, Mawatari S, Ido A, Nagata K, Matsumoto S, Takami Y, Sohda T, Kakuma T, Torimura T
  • 雑誌名: Hepatol Int. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: doi: 10.1007/s12072-019-09939-2.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of direct-acting antivirals on platelet-associated immune G and thrombocytopenia in hepatitis C virus-related chronic liver disease. (2019)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Shibata M, Hayashi T, Kusanaga M, Ogino N, Minami S, Kumei S, Oe S, Miyagawa K, Senju M, Matsuoka H, Watanabe T, Hiura M, Abe S, Harada M.
  • 雑誌名: Hepatol Int 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] A young adult patient with nonalcoholic steatohepatitis developed severe gastroesophageal varices associated with severe obesity and diabetes mellitus (2018)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Sumida K, Ogino N, Kusanaga M, Minami S, Kumei S, Matsuoka H, Watanabe T, Hiura M, Abe S, Shibata M, Harada M
  • 雑誌名: Case Reports in Gastroenterology 巻: 12 ページ: 487-496
  • DOI: doi:10.1159/000492423
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mallory-Denk体と細胞ストレス (2018)
  • 著者名/発表者名: 原田 大、本間 雄一、大江 晋司、南 創太、草永 真志
  • 雑誌名: 肝胆膵 巻: 76 ページ: 607-612
• [雑誌論文] ウィルソン病の処方 (2018)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 雑誌名: Modern Physician 巻: 38 ページ: 1181
• [学会発表] 肝細胞の様々なストレスに対する亜鉛の保護作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 草永 真志，大江 晋司，荻野 学芳，南 創太，宮川 恒一郎，本間 雄一，原田 大
  • 学会等名: 第22回ウイルソン病研究会学術集会
• [学会発表] 若年で高度の肝線維化進展に至った非アルコール性脂肪肝炎合併2型糖尿病の1例 (2018)
  • 著者名/発表者名: 秀島 宏典，本間 雄一，日浦 政明，柴田 道彦，原田 大
  • 学会等名: 第321回日本内科学会九州地方会
• [学会発表] ウイルソン病の分子機構 (2018)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 学会等名: 第54回日本肝臓学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] 銅による細胞障害に対する亜鉛の保護作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 草永 真志，大江 晋司，荻野 学芳，南 創太，宮川 恒一郎，本間 雄一，原田 大
  • 学会等名: 第54回日本肝臓学会総会
• [学会発表] C型肝炎ウイルス感染による小胞体ストレスの誘導とオートファジーの抑制 (2018)
  • 著者名/発表者名: 本間 雄一，草永 真志，荻野 学芳，倫留，南 創太，大江 晋司，日浦 政明，原田 大
  • 学会等名: 第54回日本肝臓学会総会
• [学会発表] C型肝炎ウイルスによる発癌機序の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 原田 大
  • 学会等名: 第32回犬山シンポジウム
• [学会発表] C型肝炎ウイルス感染によるオートファジーの抑制と細胞ストレス (2018)
  • 著者名/発表者名: 本間 雄一，林 倫留，草永 真志，荻野 学芳，南 創太，宮川 恒一郎，大江 晋司，原田 大
  • 学会等名: 第50回日本臨床分子形態学会総会
• [学会発表] C型肝疾患でのDAAs治療SVR例の発癌寄与因子の検討-新規線維化マーカーの有用性 (2018)
  • 著者名/発表者名: 井出 達也，江口 有一郎，原田 大
  • 学会等名: 第22回日本肝臓学会大会
• [学会発表] Hepatitis C virus infection inhibits autophagic flux via induction of endoplasmic reticulum stress (2018)
  • 著者名/発表者名: Honma Y, Kusanaga M, Ogino N, Minmai S, Oe S, Miyagawa K, Harada M
  • 学会等名: AASLD
  • 国際学会