| 研究課題/領域番号 |
18K07990
|
|---|
| 研究機関 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 |
|---|
研究代表者 |
中藤 学 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 「腸内細菌叢」プロジェクト, サブリーダー (20584535)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | TROP2 / EpCAM / 腸管上皮細胞 / 免疫細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM, TROP1)およびTROP2に共通する機能、異なる機能を明らかにするため、腸管上皮細胞で特徴的にEpCAMもしくはTROP2に依存して発現が変動する分子群、遺伝子がどのような役割を果たしているか検討した。腸管に発現する分子の比較解析から、クローディン7の安定化に関連する分子群の発現に特徴があることを見出した。その中の一つMatriptaseは、EpCAMの安定化に重要な役割を果たしていることが報告されているが、TROP2とMatriptaseの相互作用に関しては不明な点もあった。共同研究から、ケラチノサイトにおいてMatriptaseがEpCAMと同様にTROP2を切断し、切断されたEpCAMやTROP2の断片がクローディンの分解を促進する可能性があることを明らかにした。本分子機構がEpCAMを欠損したマウスに腸管上皮細胞特異的にマウスTROP2を発現するマウス（T2R）においてクローディン分子群の発現低下する要因の一つとなりうることが示唆された。
これまで消化管内にEpCAM+CD45+陽性細胞が存在すること見出し、本免疫細胞が小腸粘膜固有層に局在することを示してきた。消化管における局在をより詳細に検討するために様々な消化管部位からリンパ球を採取し検証を行った。その結果、EpCAM+CD45+陽性細胞は大腸粘膜固有層では小腸粘膜固有層と同程度の割合で存在していた。パイエル板内ではEpCAM+CD45+陽性細胞集団は存在せず、代わりにEpCAMintCD45+陽性細胞が存在することが明らかとなった。一方で、腸管上皮細胞間リンパ球ではEpCAMの発現は見られなかった。さらに、EpCAM+CD45+陽性細胞の新たな特徴として、大部分の細胞がMHCクラスII分子を高発現することを見出した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度より飼育法の工夫等により研究に必要なマウスの個体数を確保することが可能となった。これらの遺伝子改変マウスから腸管組織、糞便を採取し、腸管上皮細胞発現分子、腸内細菌叢解析の網羅的解析に向けた準備を行なった。腸管に発現する分子の比較解析を実施したところ変化があるいくつかの興味深い経路を見出すことができた。本年度は細胞接着因子の一つであるクローディンの安定性を制御するMatriptaseとTROP2の新たな相互関係を明らかにし、これらの分子の発現量の変化がT2Rマウスの腸管上皮細胞同士の接着の脆弱性に関与する可能性を見出した。
T2Rマウスでは免疫関連分子の発現が低下おり、要因として宿主側腸管上皮細胞上の細菌
接着因子やシグナル受容体の発現の変化により腸内細菌叢自体に変化が生じている可能性がある。そこで遺伝子改変マウスより糞便を回収し、細菌の16S rRNA遺伝子の網羅的解析により腸内細菌叢の変化の検討を試みる予定であった。比較するマウス間における環境要因など外的要因によるばらつき影響を少なくするため、同腹仔から糞便を回収する必要があった。比較対照マウスと比べ、T2Rマウスの出生数が十分でなく、解析に必要な個体数を揃えることが出来なかった。そのため本年度は腸内細菌叢の相違を検証することができなかった。現在、これらの課題を克服するため体外受精を実施し、十分な個体数の確保を試みている。
本研究において新規に見出した腸管粘膜固有層に存在するEpCAM陽性免疫細胞に関する詳細な分布や特徴を明らかにするため消化管の様々な部位から免疫細胞を単離し、フローサイトメーターによりEpCAM陽性免疫細胞の有無や細胞表面マーカーの検討を実施した。その結果、EpCAM陽性免疫細胞の消化管内における分布や表面にMHCクラスII分子が高発現することを明らかにした。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度見出した、Matriptase以外にもEpCAMおよびTROP2間で重複もしくは異なる機能を果たす候補因子、分子経路が複数見出されている。T2Rマウスでは腸管上皮バリア機能、抗菌ペプチドの発現量、幹細胞の増殖能の低下などの表現型が現れている。比較解析により見出した経路の中にはこれらの表現型の起因となりうる可能性のある分子の変化もあった。今後は、候補分子と表現型との相互関係を明らかにする。
EpCAMおよびTROP2は腫瘍で高発現しており、部位により腫瘍化亢進に向かうこともあれば 、逆に抑制することもある。EpCAMは酵素により分解され、細胞内ドメイン（EpICD）および細胞外ドメイン（EpEx）に分かれ、大腸がん患者においてEpICDが核内で検出され、EpExも大腸癌の進行に関与する可能性が報告されている。TROP2もEpCAM同様に酵素による分解を受け、細胞内ドメインと細胞外ドメインに分かれることがある。そこで、T2Rマウスの長期飼育もしくは薬剤誘発大腸癌モデルを使用し、TROP2もEpCAMと同様に大腸がんの発症に関与するか検討する。これらの結果とEpCAMとTROP2の機能の重複もしくは異なる機能を果たす因子の情報を関連付け、新たな腫瘍化亢進もしくは抑制機構の解明を試みる。
T2Rマウスにおける粘膜免疫と腸内細菌叢の相互関係を明らかにするため、腸内細菌叢の構成の変化の検証を継続する。また、腸管組織片と細菌特異的蛍光プローブを用いた蛍光in situ ハイブリダイゼーションを実施する。これらの結果から、T2Rで免疫関連分子の発現が低下する要因を特定する。腸管粘膜固有層に存在するEpCAM+ MHCクラスII+ 陽性免疫細胞に関しては、標的となる免疫細胞をフローサイトメーターにより分取し、回収した細胞の遺伝子発現解析を行い、免疫細胞種の特定を行う。
|
