| 研究課題/領域番号 |
18K08005
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
山本 直樹 山口大学, 大学教育機構, 准教授 (90448283)
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| 研究分担者 |
谷 健二 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (00365420)
藤澤 浩一 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00448284)
高見 太郎 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (60511251)
松本 俊彦 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70634723)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 再生医療 / 骨髄細胞 / 電子顕微鏡 / 培養骨髄細胞 / 肝硬変 / Adenylate kinase |
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| 研究実績の概要 |
全骨髄細胞投与のGFP/CCl4モデルを作成し、骨髄細胞投与後の肝組織を浮遊切片法による高感度免疫電顕法とFEI社製の透過型電子顕微鏡Tecnai12BTと走査型電子顕微鏡Qunta3D FEG Dual Beamシステムを用いて二種類の骨髄由来肝臓修復細胞である核N/C比の高い小型細胞と類円形の大型細胞の形態学的変化を解析し、トモグラフィーによる微細構造と３Ｄ立体構造構築による解析で核N/C比の高いEpCAM陽性細胞群・CXCR4陽性細胞群と類円型のMMP9陽性細胞群の特徴解析を継続して行っている。
またGFPTGマウス全骨髄細胞からMSCを分離(Veritas Easy step kit ST19771を使用)継代し培養GFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を確立させ、GFP/CCl4モデルの解析protocolと同様に持続肝障害(CCl4)モデルにPassage1～4までのそれぞれの培養細胞群を尾静脈から投与し、肝組織を摘出しGFP/CCl4モデルでの全骨髄細胞投与の場合と比較を開始,肝組織でのSirius Red染色での肝線維化評価では全骨髄細胞投与の場合の方が肝線維化抑制効果を認めた。
また我々が開発したMMP9発現細胞標識トランスジェニック(MMP9/LacZ-DsRed Tg)マウスと肝脂肪化悪化モデル(AK4KOマウス)を増殖させ、CCl4による肝線維化合併モデルを開始し、肝線維化環境下でAK4のノックアウト状態での肝細胞や星細胞等の変化を電子顕微鏡等で評価を開始し、MMP9発現増加している細胞の同定の観察を行っている。今後はGFPTGマウス全骨髄細胞あるいはGFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を投与して、肝臓内での細胞動態と機能解析を行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養・非培養の骨髄細胞による肝臓組織解析・免疫電顕による様々な抗体発現解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析など動物実験による解析がメインのため、解析・結果・再現性を得るのに時間がかかっているが、何とか実験は計画に沿って行われている。
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| 今後の研究の推進方策 |
肝線維化モデル(GFP/CCL４モデル)を利用して、さらに投与した培養・非培養骨髄細胞の特徴・相違点の解析を免疫電顕等で解析を行っていきながら、AK4 あるいはAK5 ノックアウトマウスやMMP9発現細胞標識トランスジェニックマウスとのかけ合わせによる肝臓内での投与骨髄細胞の動態や機能解析やCXCR4 KO等その他の様々な遺伝子改変マウスを利用して遺伝子欠乏環境下における投与骨髄細胞がどのような動態を示すかどのような機能や肝臓環境改善効果を示すか等の解析を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養・非培養の骨髄細胞による肝臓組織解析・免疫電顕による様々な抗体発現解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析など動物実験による解析がメインのため、解析・結果・再現性を得るのに時間がかかっているため。今後肝線維化モデル(GFP/CCL４モデル)を利用して、さらに投与した培養・非培養骨髄細胞の特徴・相違点の解析を免疫電顕等で解析を行っていきながら、AK4 あるいはAK5 ノックアウトマウスやMMP9発現細胞標識トランスジェニックマウスとのかけ合わせによる肝臓内での投与骨髄細胞の動態や機能解析やCXCR4 KO等その他の様々な遺伝子改変マウスを利用して遺伝子欠乏環境下における投与骨髄細胞がどのような動態を示すかどのような機能や肝臓環境改善効果を示すか等の解析を行っていく事に使用する。
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