| 研究課題/領域番号 |
18K08005
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
山本 直樹 山口大学, 教育・学生支援機構, 教授 (90448283)
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| 研究分担者 |
谷 健二 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (00365420)
藤澤 浩一 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (00448284)
高見 太郎 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60511251)
松本 俊彦 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (70634723)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 再生医療 / 間葉系幹細胞 / 骨髄細胞 / 肝線維化 / 肝脂肪化 / 電子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
骨髄細胞あるいはMSC投与後の肝組織を浮遊切片法による高感度免疫電顕法とFEI社製の透過型電子顕微鏡Tecnai12BTと走査型電子顕微鏡Qunta3D FEG DualBeamシステムを用いて二種類の骨髄由来肝臓修復細胞である核N/C比の高い小型細胞と類円形の大型細胞の形態学的変化を解析、トモグラフィーによる微細構造と３Ｄ立体構造構築による解析で核N/C比の高いEpCAM陽性細胞とCXCR4陽性細胞と類円形のMMP9陽性細胞の形態と特徴解析を行った。
またGFPTGマウス全骨髄細胞からMSCを分離(Veritas Easy step kit ST19771を使用)継代し培養GFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を確立し、持続肝障害(CCL4)モデルにPassage1～4までのそれぞれの培養細胞群を尾静脈から投与し、肝組織でのSirius Red染色での肝線維化評価を行った。全骨髄細胞投与の場合の方が肝線維化抑制効果を認めた。
また我々が開発した肝脂肪化悪化モデル(AK4KOマウス)とMMP9発現細胞標識トランスジェニック(MMP9/LacZ-DsRed Tg)マウスにGAN特殊飼料投与＋CCL4による肝線維化合併モデルを作成し、肝組織線維化・脂肪化環境下で肝細胞や星細胞等の変化を電子顕微鏡等で評価を開始し、このモデルに骨髄細胞あるいはMSCを投与し、線維化・脂肪化抑制効果の評価と動態解析を行った。
また新規開発した代謝系異常のAK5KOマウスを作成して、GFPTGからのGFP陽性骨髄細胞あるいはGFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を投与し、肝臓内での投与した細胞の動態と機能解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫電顕による様々な抗体発現解析・培養・非培養の骨髄細胞による肝臓組織解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析等経過時間がかかる動物実験解析がメインのため、解析・結果・再現を得るのに時間がかかっている。また新型コロナ禍の蔓延のためとウクライナとロシアの戦争のため、様々な物資高騰と調達遅延等により遺伝子改変マウス搬入の遅れや実験物品等の搬入の遅れがあり、実験は計画に沿って行っているが、少し遅れ気味になっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後も当初の計画通り、肝線維化モデル(GFP/CCL４モデル)を応用して、さらに投与した培養・非培養骨髄細胞の特徴・相違点の解析を免疫電顕等で行っていきながら、AK4またはAK5ノックアウトマウスやMMP9発現細胞標識トランスジェニックマウスとのかけ合わせによる肝臓内での投与骨髄細胞の動態や機能解析や新たにMSCにとって重要な発現を示しているCXCR4を遺伝子改変したノックアウトマウス等様々な遺伝子改変マウスを利用して遺伝子欠乏環境下における投与骨髄細胞がどのような動態を示すか、どのような機能や肝臓環境改善効果を示すかの解析を行っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養・非培養の骨髄細胞による肝組織解析・免疫電顕による様々な抗体発現解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析等動物実験解析がメインのため、解析・結果評価・再現の確認に時間がかかるため未使用額が生じた。
令和4年度に様々な免疫電顕や蛍光二重染色等検討に必要な各種試薬や遺伝子解析アレイやRNA-Seqやメタボローム解析等の消耗品の購入に充てる。
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