DNA脱メチル化動的制御による心筋細胞特異的核内構造の構築と病態発生機構の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K08085
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 小田 真由美 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任講師 (80567511)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: DNAメチル化 / 心筋細胞 / 5hmC / 細胞成熟

研究実績の概要

心臓は心筋細胞で構成される。心筋細胞は心臓の収縮機能を担い、心筋細胞特異的遺伝子の変異は先天的心筋症の原因となる。心筋細胞の病理を調べる目的において幹細胞から分化させた幹細胞由来心筋細胞は有用であるが、生体内の心筋細胞に比べて未成熟であり、長期培養しても成熟心筋細胞の特徴を獲得しないことが知られている。 このことは、主に成体の心筋細胞を対象とする病態モデル作成などにおける障壁となっている。
以前の研究より、大規模トランスクリプトーム分析から、幹細胞由来心筋細胞は長期培養後でさえも心筋細胞で成熟に伴って発現する主要な遺伝子群の発現が不十分であることがわかっている（魚崎ら、Cell Rep. 2015）。このことから、成熟過程には体系的な遺伝子発現変化が必要であることがわかる。我々の先行研究により心筋細胞はその特異的遺伝子群が「長い」という特徴をもち、さらにgene body（GB）領域のスーパーエンハンサー的（C-SE）構造を有することから、心筋細胞におけるGB領域が心筋細胞の体系的な遺伝子発現制御に役割を持つ可能性に注目している。
2018年度は、まず幹細胞由来心筋細胞（mESC-CM）におけるGB領域エピジェネティック状態の構築を調べるため、脱メチル化中間産物である5-ハイドロキシメチルシトシン(5hmC)の分布を調べた。幹細胞からの心筋細胞分化誘導において心筋細胞は幼弱であり、その成熟のために三次元培養や特殊な細胞外環境を必要とする。幹細胞由来心筋細胞が培養条件下で成熟心筋細胞としての特徴を持つため、さらに病態にある心筋細胞の異常にC-ES構造が関与している可能性について検証する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2018年度はマウスES細胞からの心筋細胞の分化誘導と5hmC分布の解析を行った。CM特異的Ncx１プロモーター駆動ピューロマイシン耐性遺伝子を有するマウスES細胞からの心筋細胞分化誘導は、2i培地中で維持後、無血清分化培地中で２日間培養、アクチビンA、BMP4添加およびVEGFの存在下で２日後、bFGF、FGF10およびVEGFをふくむ培地に再播種し3日間培養することでおこなった。さらに、非CM細胞を除くためにピューロマイシンを2～3日間添加した。10日後、心筋トロポニンT染色により心筋細胞が９０％以上であることを確認したものを幹細胞由来心筋細胞(mESC-CM)とし、必要に応じて再播種し分化後３０日目まで無血清培地で培養した。
mESC-CMサンプルを用いて、fMe-Seal-seq法によるゲノムワイドな5hmCマッピングを行った。5hmC分布を解析した結果から、培養10日目に心筋細胞特異的遺伝子のTSS下流2.0－2.5kbに5hmCの蓄積が見られることがわかった。この一過性の蓄積について、in vivoとin vitroの心筋細胞を直接比較したところ、ES細胞由来心筋細胞と新生仔心筋細胞の遺伝子発現類似性とは異なり、新生仔心筋細胞では特異的遺伝子のGB領域全体に5hmCが分布するのに対し、ES細胞由来心筋細胞ではTSS下流2kbp付近に一過性の5hmC蓄積が観察されるのみだった。この分布は心筋細胞以外でも細胞腫特異的に観察されたが、肝細胞では成熟に伴って5hmC分布が定着したのに対し、心筋細胞では定着することなく失われた。このように、心筋細胞と肝細胞のあいだには成熟に伴う5hmCのGB領域への定着に伴う5hmC分布の変化と細胞特異的な違いが観察されたため、今後この機能について解析を行う。

今後の研究の推進方策

2018年度の研究成果により、生体内心筋細胞とES細胞由来心筋細胞のエピゲノムの違いはGB領域5hmCの維持にあることが明らかになった。心筋細胞特異的なGB領域エピジェネティック状態の構築にGB領域全体への持続的な5hmC分布が必要であり、それが形成されなかった幹細胞由来心筋細胞は成熟心筋細胞がもつC-SE構造を獲得できず、成熟細胞の遺伝子発現パターンを獲得できないという仮説を立てた。
これに従い、2019年度以降の研究方針として以下の2点を中心に研究を進める。第一に新生仔心筋細胞とmESC-CMの違いを明らかにする成熟準備に必要な遺伝子を特定する。生体内の新生仔・成熟心筋細胞と幹細胞由来心筋細胞との発現の違いから成熟のボトルネック候補因子を抽出する。また、心筋細胞における成熟・未成熟の制御は新生仔心臓内で不均一であるため、成熟と未成熟の決定が新生仔心臓でどのように行われているかを上述の成熟因子の発現を、一細胞遺伝子発現解析を用いて明らかにし、いずれが成熟のボトルネック因子かを調べる。
次に、ボトルネック因子の発現を基準に新生仔心臓および病態心臓を用いて成熟転換期の心筋細胞を精製し、5hmC分布とC-SE領域の形成、その影響範囲の変化を調べる。影響範囲の解析にはMed1/Smc1を用いたChIA-PETを用いて高次構造解析を行い、5hmCターンオーバーと高次構造形成の関係性について明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

計画進行に伴い、新生仔心筋細胞の一細胞遺伝子発現解析によって細胞の分化成熟の不均一性を調べることで成熟に成功している細胞集団の特徴を抽出することが、同一環境での成熟促進の鍵となる違いを見出すのに不可欠な過程であると考えた。一細胞遺伝子発現解析はやや高額であるため、2018年度後半は5hmCの解析に集中しデータ解析に注力することで、一部を繰り越して2019年度には一細胞遺伝子発現解析を行うための予算を確保する計画に変更した。そのため、次年度使用額の申請を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Loss of TET proteins in regulatory T cells promotes abnormal proliferation, Foxp3 destabilization, and IL-17 expression. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakatsukasa H, Oda M, Yin J, Chikuma S, Ito M, Koga-Iizuka M, Someya K, Kitagawa Y, Ohkura N, Sakaguchi S, Koya I, Sanosaka T, Kohyama J, Tsukada YI, Yamanaka S, Takamura-Enya T, Lu Q, Yoshimura A
  • 雑誌名: International immunology 巻: 31 ページ: 335-347
  • DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxz008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of human pluripotent stem cells into kidney tissues by synthetic mRNAs encoding transcription factors. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hiratsuka K, Monkawa T, Akiyama T, Nakatake Y, Oda M, Goparaju SK, Kimura H, Chikazawa-Nohtomi N, Sato S, Ishiguro K, Yamaguchi S, Suzuki S, Morizane R, Ko SBH, Itoh H, Ko MSH
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 9 ページ: 913
  • DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-018-37485-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tbx6 Induces Nascent Mesoderm from Pluripotent Stem Cells and Temporally Controls Cardiac versus Somite Lineage Diversification. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sadahiro T, Isomi M, Muraoka N, Kojima H, Haginiwa S, Kurotsu S, Tamura F, Tani H, Tohyama S, Fujita J, Miyoshi H, Kawamura Y, Goshima N, Iwasaki YW, Murano K, Saito K, Oda M, Andersen P, Kwon C, Uosaki H, Nishizono H, Fukuda K, Ieda M
  • 雑誌名: Cell stem cell 巻: 23 ページ: 382-395.e5
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.07.001
  • 査読あり
• [雑誌論文] Selective modulation of local linkages between active transcription and oxidative demethylation activity shapes cardiomyocyte-specific gene-body epigenetic status in mice. (2018)
  • 著者名/発表者名: Oda M, Wakabayashi S, Ari Wijetunga N, Yuasa S, Enomoto H, Kaneda R, Yoon SH, Mittal N, Jing Q, Suzuki M, Greally JM, Fukuda K, Makino S
  • 雑誌名: BMC genomics 巻: 19 ページ: 349
  • DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-018-4752-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Regulation of Mitophagy By O-Linked N-Acetylglucosamine Transferase Is Essential for Hematopoietic Stem Cell Maintenance (2018)
  • 著者名/発表者名: Murakami K, Kurotaki D, Kawase W, Soma S, Fukuchi Y, Kunimoto H, Yoshimi R, Koide S, Oshima M, Hishiki T, Hayakawa N, Matsuura T, Ko M, Oda M, Yanagisawa K, Kobayashi H, Atobe Y, Funakoshi K, Iwama A, Takubo K, Okamoto S, Tamura T and Nakajima H
  • 雑誌名: Blood 巻: 132 ページ: 171
  • DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2018-171
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] The relationship between DNA methylation dynamics and cardiomyocyte- specific epigenetic domain formation in cardiomyocyte maturation (2019)
  • 著者名/発表者名: Mayumi Oda
  • 学会等名: BDR symposium 2019 "Control and Design of Biosystems"
  • 国際学会
• [学会発表] 試験管内心筋細胞分化における細胞成熟と細胞種特異的エピジェネティック・ドメイン形成 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小田 真由美、魚崎 英毅
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 心筋細胞特異的遺伝子の転写伸長反応と成熟過程における細胞種特異的エピジェネティック・ドメイン構築の影響 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小田真由美
  • 学会等名: RNAフロンティアミーティング2018
• [学会発表] Gene bodyエピジェネティック修飾の細胞種特異的不均一性と進化的ゲノム配列要素選択の関与 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小田真由美
  • 学会等名: 日本エピジェネティクス研究会第12回年会
• [備考] 慶應義塾坂口光洋記念講座 テニュアトラック・プログラム 助教・小田真由美
  • URL: http://www.careerpath-prj.keio.ac.jp/sakaguchi/scholar/m_oda/
• [備考] Research gate: Mayumi Oda
  • URL: https://www.researchgate.net/profile/Mayumi_Oda