| 研究課題/領域番号 |
18K08105
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
新谷 泰範 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (20712243)
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| 研究分担者 |
塚本 蔵 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (80589151)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | AMPK / 微小管 |
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| 研究実績の概要 |
細胞膜に局在するPM-ABCARを発現するTGラット心臓より成熟心筋細胞を単離し、浮遊した状態で細胞接着が保たれたpaired cellsを選別し、ガラスピペットで進展刺激を加える実験系の構築を目指したが、残念ながら細胞のダメージが大きく再現性のよい実験系の確立が困難であった。しかし、ストレッチ刺激装置（STREX）を用いた方法、あるいは心筋細胞に収縮刺激、収縮停止剤をくわえることによりメカノストレスを変化させ、微小管のdynamicsとの関連を示すことができた。
In vivoの解析は、AMPKによるCLIP-170のリン酸化部位に変異を加えた S311A TGマウスにおいて、有意な線維化と心収縮力の低下を認め、さらにドキソルビシン負荷心不全モデルに供したところ、コントロールに比べさらなる心機能の悪化を認めた。組織学的な検討でも心筋組織内に微小管の蓄積をみとめ、また電子顕微鏡による観察では介在板の構造異常が観察された。リン酸化を模倣するS311D TGマウスでは、S311Aとは対照的に有意な変化を認めず、CLIP170のリン酸化の意義を確立した。これらの結果をまとめ、現在論文投稿中である。
さらに2019年度には、介在板におけるAMPKの基質の探索をおこない、新規基質Xを同定した。Xはこれまで既報がまったくない機能未知の分子であった。In vitro kinationにてAMPKによりリン酸化されることを確認した後、Crispr-Cas9法によりノックアウトマウスを作成した。ノックアウトマウスはメンデルの法則にしたがって生まれ、正常に発育し、特に心機能の異常は認めなかった。しかしながら、圧負荷心不全モデルに供するとWTコントロールに比較して、有意な心機能の低下をみとめた。2020年以降分子メカニズムの解明を行っていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画通りに進展している
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| 今後の研究の推進方策 |
AMPKによる微小管dynamicsの制御については論文報告をすすめる。また新規に同定した遺伝子Xの機能解析をすすめるため、リン酸化抗体の作成、免疫沈降、免疫染色が可能なモノクローナル抗体をKOマウスに免役することにより作成する。同時に心筋細胞において遺伝子Xを強制発現、あるいはノックダウンし、RNAシークエンスによる発現解析をこころみ、その機能解明を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は計画していた実験が予定よりはやく終了したため、使用額が少なくなりました。来年度は抗体作成など、研究の進展に伴う経費の拡大も予定しております。
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