| 研究課題/領域番号 |
18K08130
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
榊原 純 (小西純) 北海道大学, 大学病院, 講師 (50374278)
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| 研究分担者 |
木下 一郎 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (40343008)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Numbの機能 |
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| 研究実績の概要 |
1.肺癌切除組織におけるNumb、Notch1発現の臨床病理学的因子との相関、予後の検討
肺癌切除組織(肺腺癌168症例、肺扁平上皮癌120症例)におけるNumb、Notch1発現を免疫組織学的に検討した。一次抗体にNumb抗体（1:500, ab14140, Abcam）、Notch1抗体（1:400, #3608, Cell Signaling）を使用し免疫染色を行った。腫瘍細胞は5視野においてそれぞれ100個ずつカウントし症例ごとの陽性率を検出し、全症例の陽性割合の中央値をcut offとし高発現群、低発現群に分けて臨床因子学的背景との相関、予後との関連を検討した。肺腺癌症例においてNumb高発現群で低発現群と比較して有意に予後良好であったが（P=0.004)、肺扁平上皮癌においてはnumb発現は予後に影響を及ぼさなかった。Notch1については肺腺癌でNotch1低発現で有意に予後良好（P=0.002)であり逆に肺扁平上皮癌で予後不良な傾向であった（P=0.08)。
2. Numb抑制時の腫瘍増殖、遊走能、浸潤能に関する機能の検討
はじめに肺腺癌細胞株（HCC2429, A549）、扁平上皮癌細胞株（H1703, H520）におけるNumb、Notch関連蛋白の発現をウエスタンブロット法にて検討した。それぞれの細胞株で発現に差はあるがNumb、Notch受容体の発現を認めた。これらの細胞株にNumb siRNAをトランスフェクションにてNumbを抑制後、足場依存性または足場非依存性増殖をMTT assayで検討した。腺癌細胞株でNumb抑制にて増殖能が低下し扁平上皮癌細胞株で増殖能は増加した。また遊走能、浸潤能に関してもNum抑制により腺癌で低下、扁平上皮癌では上昇した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定として免疫染色によるNumb,Notch1の蛋白発現の評価を行うこととしていた。必要な切除標本の確保、患者背景を収集することができた。また免疫染色方法、染色評価方法について確立することができたため全症例の免疫染色を施行、染色評価を行い、予後との比較など予定した内容を終了した。
細胞実験に関してもNumb抑制による細胞増殖能の評価を行う予定であり、Numb siRNA実験の確立しNumb抑制に成功し。さらに、増殖能、浸潤能、遊走能の実験方法を確立することができた。Numb抑制における増殖能、浸潤能、遊走能ともに肺腺癌、扁平上皮癌ごとに違いを認め予想していた結果をえることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.Numb過剰発現時の腫瘍増殖、遊走、浸潤に関する機能の検討。肺腺癌細胞株（HCC2429, A549）、扁平上皮癌細胞株（H1703, H520）においてNumb-ORF plasmid（Origene Technology）をトランスフェクションしNumb過剰発現細胞株を作成し同様の実験を行う増殖能、遊走、浸潤に関する機能を検討する。
2.NumbとNotch pathwayの関連性の検討。NumbはNotch pathwayを抑制的に制御することが報告されておりNumbをsiRNAやCrisper/Cas9で抑制またはNumb-ORF plasmidをトランスフェクションし過剰発現したときのNotch受容体、標的遺伝子であるHES1,HEY1の発現を検討する。さらにNotch pathwayはEMT（Epithelial Mesenchymal Transition）を制御することが報告されており、Numb ノックダウン細胞またはNumb過剰発現細胞での細胞形態の変化、EMT markerであるE-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slugの発現をウエスタンブロット法で検討する。NumbがNotch pathwayを介して細胞増殖制、EMT制御を行っているかを確認するためにNumbノックダウン細胞でNotchをsiRNAを使用した場合にNumbノックダウンの効果がrescueされるかを確認する。
3.Numb機能のin vivoでの検討。Crisper/Cas9でNumbをノックダウンした細胞とコントロール細胞、またNumb 過剰発現細胞とコントロール細胞をそれぞれヌードマウスに皮下接種し腫瘍のサイズを測定する。その際マウスの腫瘍組織を切除し腫瘍組織におけるNumb、Notch関連蛋白の発現を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
おおむね予定していた研究は終了したが、ベクターの購入、トランスフェクションに時間がかかった。今後予定している研究としてNumbを過剰発現し細胞増殖能、遊走能、浸潤能を検討する予定で、過剰発現に使用するベクター、トランスフェクション用試薬を使用予定。また細胞実験における細胞培養関連の試薬、培養液などを使用予定である。また今後動物実験予定でありマウスの購入費用、飼育に関わる費用が必要となる。
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