2020 年度実施状況報告書

サルコイドーシスにおける制御性Ｔ細胞の機能と治癒機構からみた治療法の解明

研究課題

研究課題/領域番号	18K08147
研究機関	大分大学
研究代表者	安東優大分大学, 医学部, 客員研究員 (20336267)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2022-03-31
キーワード	サルコイドーシス / 制御性Ｔ細胞 / 免疫寛容
研究実績の概要	サルコイドーシス（サ症）における肉芽腫形成過程の解析は多くなされているが、改善過程に焦点をあてた研究はほとんどない。Tregの機能が活動期では低下し回復期には改善するとの研究報告があることから、予想される結果は、改善過程時ではTregの復元によるIL-10産生能の増加が予測れ、その復元にはTGF-βやIL-35によるTregの活性化が関与するのではないかと推測される。また、最近の研究では、サ症の肉芽腫形成に活性化したTh17リンパ球が集簇し、Th17と抑制的に働くTregとのバランスで肉芽腫の形成がコントロールされる。Th17 上に発現するCCR6は、CCL-20に特異的に結合することが知られており、CCL-20は類上皮細胞肉芽腫やマクロファージに発現している。したがって、サ症においては肉芽腫やマクロファージから産生されるCCL-20 を介してTh17が集簇する機序が推定され、疾患活動性マーカーとなる可能性があるが、その詳細については明らかではない。本研究の目的は、新たな治療ターゲットとなるTregおよびIL-10発現細胞と疾患活動性、予後との関連を調べ、IL-10発現を制御するであろうTGF-β、IL-35との関連を明らかにすることである。また、Tregと相反的に働くTh17の肉芽腫形成への関与、およびその機序について明らかにしたい。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由本年度はコロナパンデミックの影響でほとんど実験ができなかった。
今後の研究の推進方策	1)PBMC中IL-10, TNF-α, IFN-γmRNA発現量とTregの発現頻度の検討：　活動期10例、非活動期10例、健常ボランティア10例からPBMCを採取する。24時間培養後1mlをRealtime PCR用に採取し、残りを濃縮しフォローサイトメトリーを実施しTreg、Il-10産生細胞の発現を測定する。2)Treg分離培養、IL-10、IL-35、TGF-β産生の検討：　活動期、非活動期、健常コントロールそれぞれ10例から末梢血を採取し、cDNAライブラリーを作成する。IL-10、IL-35、TGF-βの発現をRealtime PCRで定量する。3)PBMC産生サイトカイン及びTreg発現の経時的変化：　診断時と3～6ヵ月後の2pointで採血し、Treg、IL-10産生発現頻度、IL-10、IFN-γ、TNF-αmRNA量が予後予測因子になるか検討する。4)肺肉芽腫マウスモデルにおけるTreg機能の解析： Tregを標識したFoxP3GFPマウスを用い肺肉芽腫モデルを作成し、Day0, day3, day7, day14, day28に血液、BALF中のTreg（GFP陽性細胞）の発現頻度をフローサイトメトリーで測定する。活動期にはTregが不活性化され、改善期には回復している可能性があるため、マウスモデルで活動期day 3, 改善期day 28にBAFLを採取しTregを抽出し、CTLA-4及びCD25遺伝子発現をリアルタイムPCRで定量し比較する。
次年度使用額が生じた理由	最終年度までに研究が終了しなかったため。現在、サ症の血清、BALサンプルを集積し、終了している。エライザーキットも購入済であるので、CCR-6とCCL-20の追加測定は行う予定である。同時にPMBC分離、培養実験も継続する。