| 研究課題/領域番号 |
18K08163
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| 研究機関 | 公益財団法人結核予防会 結核研究所 |
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研究代表者 |
土方 美奈子 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 生体防御部, 部長 (90332387)
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| 研究分担者 |
慶長 直人 公益財団法人結核予防会 結核研究所, 副所長, 副所長 (80332386)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | びまん性汎細気管支炎 / 副鼻腔気管支症候群 / 非嚢胞性肺線維症性気管支拡張症 / ムチン遺伝子 / 遺伝バリアント |
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| 研究実績の概要 |
我々は、ヒト6番染色体のびまん性汎細気管支炎(DPB)疾患感受性候補遺伝領域内に新規ムチン遺伝子PBMUCL1（MUC22）・PBMUCL2をクローニングしたが、HLA領域に特有の連鎖不平衡状態とムチン遺伝子の長いリピート配列のため、従来のサンガーシークエンス法では解析に限界があった。最近この領域は、喘息との関連が報告され、また、MUC22はHLA領域で最も多型に富む遺伝子であるとされ、注目されている。本研究では、MUC22を中心とする領域の遺伝的多型が、アジア人の非嚢胞性肺線維症性気管支拡張症や近年急増する肺非結核性抗酸菌症など、様々な疾患と関連しているのではないかと考え、我々が既に集めた日本人のDPBを含む検体とベトナム人の副鼻腔気管支症候群検体の２か国のパネルで新しいシークエンス技術で再解析し、国際比較することにより、疾患関連候補領域をさらに狭めて、アジア人に特有の気道脆弱性に関わる遺伝的素因を明らかすることを目指している。 今年度は、日本人DPB検体、ベトナム人副鼻腔気管支症候群検体を用い、まずDPB疾患感受性候補遺伝領域の中の約120 kbを、最大7kb長程度までの約30領域に分けてオーバーラップさせながらPCRで増幅した。PCR産物を患者ごとにプールしてライブラリー作成を行い、イルミナ社の次世代シークエンサーMiSeqでシークエンスを行い、特に過去にPCR～サンガー法での解析が全く不可能であったMUC22のintron 2の10 kbについては、さらにDPB患者の検体数を増やしてMiSeqで配列解析を行った。これらの結果から、120kbの領域中でリピート配列のためにバリアント解析が困難で、長鎖シークエンサーによる解析が必要とされる領域を抽出し、Oxford Nanopore社のMinIONシークエンサーを用いたシークエンスの条件検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
解析対象とするゲノム領域をPCRで増幅してシークエンス解析を行うターゲットリシークエンス法を用いているが、MiSeqを用いた遺伝バリアント解析の結果、既知の単塩基多型部位のヘテロ接合体において、全リード中の変異アリル由来のリード数の割合に大きな偏りがある領域が見られ、PCR増幅がアリル間で均等に行われていないことが原因と考えられた。このため、解析に必要なデータ量の再考と、我々が通常用いている次世代シークエンサーデータの解析パイプラインの解析条件設定の最適化を行い、片アリルから得られるリード数が少なくてもヘテロ接合体と判定できるようにすることが、本研究が対象とするゲノム領域の網羅的なバリアント探索において必要と考えられ、現在、方法の修正を行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、長鎖型のOxford Nanoporeシークエンサー（GridION、MinION）と短鎖型のイルミナ社MiSeqシークエンサーから得られたデータをあわせ、日本人のDPB患者検体とベトナム人の副鼻腔気管支症候群患者、さらに両国の健常人検体を解析して、今まで日本人集団の中だけでは絞り込めなかった疾患感受性領域をより狭めて、機能的に重要と思われる遺伝バリアントとハプロタイプを明らかにすることを目指す。さらに、我々が既に保有する初代培養気道上皮細胞パネルの中から、上記ハプロタイプを有するサンプルとコントロール検体を選び、遺伝子発現解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Oxford Nanopore社のMinIONを用いたシークエンスを行うにあたり実験条件の修正が必要になり、１回分のシークエンスランの試薬消耗品代相当額を次年度使用に持ち越して、次年度に新しい条件で行うこととした。
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