| 研究課題/領域番号 |
18K08179
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
柳 重久 宮崎大学, 医学部, 助教 (60404422)
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| 研究分担者 |
松尾 彩子 宮崎大学, 医学部, 医員 (40776332)
坪内 拡伸 宮崎大学, 医学部, 助教 (60573988)
松元 信弘 宮崎大学, 医学部, 助教 (70418838)
三浦 綾子 宮崎大学, 医学部, 研究員 (70710903)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞老化 |
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| 研究実績の概要 |
慢性閉塞性肺疾患と特発性肺線維症におけるII型肺胞上皮(alveolar type 2: AT2)内分子の意義を、組織幹細胞ニッチを制御する細胞老化/細胞移動調節機構という独創的な観点から解明し、両疾患に対する治療戦略を創出することが本研究の目的である。本年度はSftpcCreERT2マウスとPtenfloxマウスを交配し、8週齢より週3回タモキシフェン(TMX, 250mgkg-1)を腹腔内投与し、AT2特異的Pten欠損マウスを作製した。並行して、Magnetic enrichmentとFACS sortingを組み合わせ、AT2と肺間葉細胞それぞれの単離プロトコルを確立した。AT2でのPten遺伝子の欠失効率について単離AT2(CD31 neg CD45neg CD16/32neg TER119neg EPCAM pos)のqPCRで確認したところ、AT2での90%強のPten発現低下を確認した。FACS解析の結果、AT2特異的Pten欠損マウスではAT2の割合が有意に減少し、肺間葉細胞の割合が増加していることを見出した。エラスターゼ気管内投与による肺損傷モデルにおいて、AT2特異的Pten欠損マウスでは気腫性病変が増悪することを見出した。現在、AT2特異的Pten欠損マウスに30週齢まで週1回TMXを腹腔内投与することで、加齢性の肺気腫自然発症の有無について検討を進めている。また、肺胞ニッチ細胞(mesenchymal alveolar niche cell: MANC)の標識に必要なPdgfra-EGFPマウス, Axin2-TQマウスについて遺伝子組換え実験委員会の承認を得た。動物実験委員会に申請中である。来年度以降、AT2の細胞老化の有無、AT2でのミトコンドリア機能、単離AT2と肺間葉細胞のRNAシーケンスを用いたAT2-肺間葉細胞間シグナル解析を進捗する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要にあるように研究計画はほぼ順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損マウス作製による肺気腫、肺線維症自然発症の解析-SftpcCreERT2:RhoAfloxマウス、SftpcCreERT2:Ror2floxマウスまたはSftpcCreERT2:Ptenfloxマウスに8週齢より週1回TMXを腹腔内投与する。10週齢と30週齢の各遺伝子欠損マウスを用い、肺気腫自然発症の有無をmicro-CT (Voxel Count)と肺組織HE染色(平均肺胞径(MLE)と断片指数(DI))で、肺線維症自然発症の有無をM-T染色、肺組織中コラーゲン値測定で解析する。AT2の細胞骨格変化をファロイジン-アクチン染色で評価する。基底膜とAT2, AT1の接着とAT2-AT1間連結を電子顕微鏡で解析する。
(2) AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損による肺胞間葉ニッチ細胞と筋線維芽細胞前駆細胞(AMP)の数量変化-SftpcCreERT2: RhoAflox(またはRor2floxまたはPtenflox)マウスにAxin2-TQマウスとPdgfra-EGFPマウスを交配しTMX投与によりAT2特異的にRhoAまたはRor2またはPtenを欠損、かつMANC(Axin2+PDGFRα+)とAMP(Axin2+)がlineage-tracingされるマウスを作製する. MANC数とAMP数をFACSで解析する。
(3)AT2特異的RhoA/Ror2/Pten欠損によるAT2-MANC間の距離変化-上記実験(2)のマウス肺組織を用い、AT2をSftpcで免疫染色する。Z-stacksによる三次元的共焦点画像解析により、AT2の核とMANC(Axin2+-PDGFRα+)の核間の距離を測定し、AT2内分子が与えるニッチの空間分布への影響を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ニッチ細胞標識マウスの動物実験計画書の承認が2019年5月となったため。次年度に次年度使用額を合わせてニッチ細胞標識マウスを購入する。
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