| 研究課題/領域番号 |
18K08226
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
松田 裕之 日本大学, 医学部, 助教 (10646037)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | COMMD5 / HCaRG / 上皮細胞バリア / 急性腎障害 / E-cadherin |
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| 研究実績の概要 |
Hypertension-related, calcium-regulated gene(HCaRG/COMMD5)は腎臓の尿細管に強く発現しており、障害により脱分化した尿細管上皮細胞の再上皮化を促し、尿細管の修復を促進し、腎障害後の腎機能や生存率を改善させる。また、HCaRGは、細胞骨格の構成因子であるアクチンとRab5に結合し、EGFR受容体の細胞内輸送及びリサイクリングをコントロールし、腎癌細胞の増殖を抑制し、Sphere形成能といった癌幹細胞性を低下させていることが分かってきた。今回、過度な障害などによる尿細管上皮の脱落によりHCaRGの発現が失われ、尿細管上皮バリアの恒常性が維持できず、腎臓病が発症・進展するのではないかと仮説を立てた。本研究では、急性腎障害におけるHCaRGの尿細管保護メカニズムを解明するために、近位尿細管特異的HCaRG高発現マウスを用いて急性腎障害モデルの一つであるシスプラチン腎症を作製し、実験を行った。遺伝子改変マウスでは、シスプラチン投与後の腎機能障害・組織障害・アポトーシス・ミトコンドリア障害が、野生型マウスに比べ有意に軽減していた。さらに、E-cadherinやβ-cateninといったアドヘレンスジャンクションの構成タンパクの発現も有意に保たれていた。腎保護作用のメカニズムとしては、HCaRGが近位尿細管におけるE-cadherinの発現をコントロールし、尿細管上皮細胞間の接着を増強することで、尿細管上皮バリアを強固にし、シスプラチン暴露への耐性を高めていると考えられた。そして、尿細管上皮バリアの維持により、腎間質や遠位尿細管が健全に保たれることで、尿細管及び間質の相互作用により急性腎障害の発症や慢性腎臓病への進展が抑制されるのではないかと期待された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
近位尿細管特異的HCaRG高発現遺伝子改変マウスを用いて行ったシスプラチン腎症の実験では、外因性HCaRGにより腎機能障害や、尿細管や間質の組織障害が軽減していた。そして、遺伝子改変マウスの腎臓では、野生型マウスに比べて、細胞死やミトコンドリア障害、酸化ストレスが有意に軽減されていた。E-cadherinやβ-cateninの発現は、特に遺伝子改変マウスの尿細管で保たれており、近位尿細管と遠位尿細管の各セグメントの遺伝子発現を解析したところ、近位尿細管由来のHCaRGが、近位尿細管だけでなく遠位尿細管や間質の障害も軽減しており、遠位尿細管由来の腎保護因子であるKlothoやBMP-7、間質由来の造血因子であるエリスロポエチンの発現が遺伝子改変マウスにおいて有意に保たれていた。以上より、近位尿細管におけるHCaRGは、障害を受けた近位尿細管上皮細胞の修復を促進するだけでなく、シスプラチンといった腎毒性のある物質に尿細管が暴露された際に、E-cadherinのup-regulationを介して、近位尿細管細胞のアドヘレンスジャンクションを強固にし、上皮バリアを維持することで間質や遠位尿細管の障害を軽減し、急性腎障害の発症や進展を抑制しているのではないかと考えられた。E-cadherinの発現制御メカニズムとしては現在までの細胞実験の結果等から、① p21の誘導を介して、E-cadherinのプロモーターを活性化させている可能性と、② VPS (Vacuolar protein sorting)タンパク質との相互作用により、E-cadherinのエンドサイトーシス及びリサイクリングを調整している可能性が考えられた。今後、HCaRGを中心とした尿細管上皮バリアの維持機構を明らかにし、尿細管上皮バリアと腎疾患の進展について学会や学術論文を通して発表していく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
HCaRGを中心とした尿細管上皮バリアの維持機構を検討するために、近位尿細管におけるHCaRGコンディショナルノックアウトマウスの作製を、タモキシフェン誘導性Creを発現するNDRG1-CreERT2マウスとHCaRG floxedマウスの交配により行っている。このマウスを用いて、近位尿細管のHCaRGを特異的にノックダウンした際に、近位尿細管の上皮バリアはどのように変化するのか、遠位尿細管や間質の障害は悪化するのかどうかを、急性腎障害モデルであるシスプラチン腎症や腎虚血再還流モデルにて検証する予定である。これまでの細胞実験の結果から、HCaRGがE-cadherinの発現を制御しており、細胞間接着を強固にすることで、上皮細胞の抵抗性を増強し、ミトコンドリアの障害や細胞死が軽減していることが分かっている。実際に、シスプラチン暴露下の培養細胞では、HCaRGによりp21の転写因子の一つであるFoxOタンパクのリン酸化が抑制され、Total FoxOのタンパク量は増加し、E-cadherinの発現が亢進していた。今後、E-cadherinの発現制御メカニズムを検討するために、HCaRG合成タンパクを用いて、E-cadherinプロモーターの活性化に与える影響を検討する予定である。また、HCaRGの関わる新たな伝達経路を明らかにする目的で、免疫沈降と質量分析を行い、HCaRGの相互因子の探索を行ったところ、E-cadherinのエンドサイトーシスにも関わるタンパク複合体であるVPSタンパク質が候補として挙がった。今後、細胞内でのHCaRGとの結合や相互作用を検討し、HCaRGがE-cadherinタンパク質のリサイクリングに関与しているのかどうかを検討して行く予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由) 現在、HCaRG floxedマウスを作製し、繁殖・系統維持を行っている。共同研究機関よりタモキシフェン誘導性Creを発現するNDRG1-CreERT2マウスの供給を受け、近位尿細管におけるコンディショナルノックアウトマウスを作製するために、HCaRG floxedマウスとNDRG1-CreERT2マウスの交配を行っており、繁殖数や飼育数に相違が生じたため次年度使用額が生じた。
(使用計画)
HCaRG floxed;NDRG1-CreERT2マウス(近位尿細管特異的HCaRGノックアウトマウス)の系統を樹立した後に、急性腎障害モデルであるシスプラチン腎症や腎虚血再還流モデルを作製し、HCaRGの腎保護メカニズムを検証する予定である。そこで、翌年度分として請求した助成金と合わせて実験動物の飼育、及び病態モデル動物の免疫組織や遺伝子発現を解析するために必要な消耗品の購入等に充てる。
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